Numb蛋白對α-synuclein蛋白寡泛素化水平的調控

王 躍， 丁雪冰， 王雪晶，2， 張雯雯， 荊 婧， 馬耀華， 滕軍放，2

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常見的中樞神經系統變性疾病之一，其主要病理變化為黒質-多巴胺系統受損使多巴胺神經元大量減少，導致運動遲緩、肌強直、震顫等錐體外系癥狀出現。α-突出核蛋白(α-synuclein，α-syn)是一種在腦組織中含量豐富的小蛋白質，尤其在神經元細胞漿高表達，相對分子質量為18～20 kD，α-syn蛋白發生部分折疊并相互作用形成寡聚體，α-syn寡聚體聚積產生細胞毒性導致神經元變性與PD的發生、發展有密切的聯系［1］。Numb基因是首個被發現的決定細胞不對稱分裂的基因，通過Numb/Notch途徑在生物的神經發育中發揮著重要作用。Numb蛋白與Notch蛋白通過相互拮抗作用調控UPS，參與某些蛋白的的泛素化修飾［2］。目前，國內外關于Numb蛋白對α-syn蛋白寡泛素化水平調控的研究尚未見報道。本研究通過檢測Numb與α-syn的相互作用，旨在深入探求Numb蛋白對α-syn寡泛素化水平的調控及誘導α-syn包涵體形成的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)為中南大學湘雅醫院唐北沙教授饋贈，EGFP-N1、EGFP-Numb、HA-α-synuclein 為蘇州大學王光輝教授饋贈。ProteinG購于羅氏公司，DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購于美國GIBCO公司，轉染試劑脂質體LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 SH-SY5Y細胞培養于含15%FBS的DMEM完全培養液中，置于37℃、5%CO2細胞孵育箱中培養。質粒轉染步驟參考脂質體LipofectamineTM2000說明書進行。

1.2.2 細胞免疫熒光檢測Numb蛋白和α-syn蛋白的亞細胞共定位 將轉染后的SH-SY5Y細胞在37℃、5%CO2培養箱中培養48 h，然后用1×PBS洗滌2次后加入4%的多聚甲醛，室溫下固定10 min，再用1×PBS洗滌3次，加入0.25%的TritonX-100/PBS透化10 min，經1×PBS洗滌后，加入一抗α-FLAO/PBST室溫下孵育2 h，經1×PBST洗滌3次后加入二抗 α-mouse-Rho/PBST室溫避光1h，再經1×PBST洗滌3次后，加入Hochest于室溫下避光孵育3 min復染細胞核，經1×PBST洗滌3次后用熒光顯微鏡觀察，并在400倍視野下，在各組細胞隨機抽取3個以上不相重復的視野觀察拍照。

1.2.3 免疫共沉淀 轉染24 h后，加入10 μmol/L MG132處理，24 h后收集細胞，經細胞裂解液裂解后于冰上放置10 min，4℃下12000r/min離心25 min后收集上清，取40μl上清加入等體積Loading buffer 100℃煮沸10 min，4℃保存。其余上清用于免疫共沉淀實驗。取40μl Protein G分別加入30μl 5%BSA、700μl PBS以及4μl相應抗體，4℃ 孵育6 h，洗滌沉淀3次，加入上述剩余上清液4℃ 過夜。次日，冰上震蕩2 h，反復洗滌8次。去上清加入等體積Loading buffer 100℃煮沸7 min。離心取上清進行Western-blot檢測。

1.2.4 Western-blot檢測 取 10 μl上清進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，將分離后的蛋白轉移到硝酸纖維濾膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，在1×TBST中洗滌3次，加入相應一抗，4℃ 孵育過夜。次日，用1×TBST洗膜3次后加入相應的二抗，室溫下在搖床上孵育2 h，洗膜后加入ECL試劑，暗室內X膠片曝光顯影。

1.2.5 細胞免疫熒光檢測 α-syn包涵體 將SH-SY5Y細胞以4×105/ml接種于六孔板里，取對數生長期細胞，加入終濃度為1 mmol/L的MPP+處理36 h，分別將EGFP-N1或EGFP-Numb轉染SHSY5Y細胞，轉染24 h后經4%的多聚甲醛固定、0.25%的TritonX-100/PBS透化，經1×PBS洗滌后，加入一抗 α-FLAO/PBST室溫下孵育2 h，經1×PBST洗滌3次后加入二抗α-mouse-Rho/PBST室溫避光1 h，再經1×PBST洗滌3次后，加入Hochest于室溫下避光孵育3 min染細胞核，經1×PBST洗滌3次后用熒光顯微鏡觀察，在熒光顯微鏡下隨機選擇3個以上視野進行觀察。

2 實驗結果

2.1 Numb蛋白與α-syn蛋白的亞細胞共定位

細胞免疫熒光結果顯示，將EGFP-Numb與HA-αsyn共同轉染SH-SY5Y細胞，可見HA-α-syn呈核周分布，EGFP-Numb呈全細胞分布，核膜周圍較明顯，Numb蛋白與α-syn蛋白在SH-SY5Y細胞中存在亞細胞共定(見圖1)。

2.2 Numb蛋白與α-syn的結合 分別將EGFP-N1或EGFP-Numb與HA-α-syn共同轉染后進行免疫共沉淀，經Western-blot分析，結果顯示，與EGFP-N1組對比，過表達EGFP-Numb組的沉降復合物中可檢測到α-syn蛋白的存在，表明Numb蛋白與α-syn蛋白相互結合(見圖2)。

2.3 Numb上調α-syn寡泛素化水平 分別將EGFP-N1或EGFP-Numb與HA-α-syn共同轉染，24 h后加MG132處理。轉染36 h后收集細胞裂解液，用anti-HA抗體進行免疫沉淀后、用anti-Ub檢測αsyn泛素化水平。Western-blot檢測結果顯示，與EGFP-N1組相比，EGFP-Numb組的α-syn寡泛素化水平明顯上調(見圖3)。

2.4 Numb誘導MPP+細胞模型中α-syn包涵體的形成 細胞免疫熒光結果顯示，在MPP+細胞模型中，與 EGFP-N1組相比，EGFP-Numb組中 αsyn包涵體增多。這表明Numb促進MPP+誘導的α-syn包涵體形成(見圖4)。

圖1 SH-SY5Y細胞中Numb與α-synuclein的亞細胞共定位1-A中紅色標記α-syn表達;1-B綠色標記Numb表達;1-C藍色標記細胞核;1-D中箭頭所指Numb與α-syn共定位

圖2 Numb與α-syn相互結合。過表達EGFP-Numb的沉降復合物檢測到α-syn蛋白

圖3 Numb蛋白促使α-syn蛋白的寡泛素化水平上調

圖4 Numb蛋白促進MPP+誘導的α-syn包涵體形成。與EGFP-N1組對照，過表達Numb的MPP+細胞模型中α-syn包涵體增多(箭頭所指)(scale bar=20μm)

3 討論

α-synuclein蛋白是由140個氨基酸構成的小分子蛋白質，在大腦皮層、海馬、杏仁核和嗅球含量豐富，多集中于神經元突觸前末梢、核膜及細胞質中。其生理功能尚不清楚，可能與突觸的可塑性、神經遞質的傳遞及高爾基、內質網的轉運網絡有關。作為帕金森病病理特征的Lewy小體中含有豐富的纖維化的 α-syn蛋白［3］。有研究發現，在 α-syn纖維化的過程中形成的初原纖維化的α-syn及寡聚體具有細胞毒性，而α-syn寡聚體細胞毒性更強，致使多巴胺神經元損傷，參與帕金森病的病理過程［4，5］。

泛素是一種含有多個賴氨酸殘基的小分子蛋白質，其功能包括參與細胞的分裂、生長、細胞間的信號傳導、細胞凋亡等。這些功能都是通過泛素-蛋白酶體系統(UPS)實現的。蛋白質的泛素化修飾包括多聚泛素化和寡泛素化修飾兩種修飾方式，某些膜蛋白和可溶性蛋白可被單泛素或寡泛素修飾［6］，寡泛素化修飾參與蛋白折疊的調節、胞漿運輸以及胞吞過程［7］。Lee等人研究發現Siah-1可與 α-syn蛋白相互結合，促進 α-syn寡泛素化修飾［8，9］。王雪晶等研究發現BAG5通過調節帕金森相關Pakin蛋白抑制α-syn泛素化降解，促使 α-syn聚集體增多［10］。Crews等人發現α-syn蛋白通過調控Notch1水平參與了鼠神經細胞發生過程［11］。

Numb是一種進化上保守的膜相關蛋白，是細胞不對稱分裂的決定因子，其在神經系統及成熟的組織中廣泛存在。Numb與多種信號通路關系密切，如Notch、WNT等信號通路，其中Numb/Notch信號通路在細胞增殖分化、神經系統發育、腫瘤的生成等方面研究較多。Susini等人發現Siah-1蛋白與Numb蛋白相互結合，并因而促進Numb蛋白通過泛素-蛋白酶體系統降解［12］。

Numb蛋白通過UPS調節p53的降解，參與了乳腺癌的病理過程［13］。Chan SL等人研究發現Numb蛋白通過抑制細胞內鈣離子釋放參與了AD發病過程，從而為Numb參與神經系統退行性疾病的病理過程提供了理論依據［14］。Schmit等研究發現Numb與tubulin存在亞細胞共定位，Numb與Tubulin相互作用致使 tubulin表達上調［15］，Chen L及Esteves AR等人研究發現tubulin與α-syn存在共定位，在體外實驗中Tubulin可促使α-syn寡聚體積聚，誘導 α-syn 包涵體形成［15，16］。由此推測，Numb可能與α-syn相互作用誘導α-syn包涵體形成從而參與帕金森病的病理過程。

1-甲基4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyr-idium，MPP+)是神經毒素 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)經B型單胺氧化酶氧化生成的活性物質。MPP+被多巴胺能神經元攝取后可抑制線粒體復合物I的功能，損傷線粒體，導致多巴胺能神經元的變性死亡，產生類似PD的臨床表現及病理變化。SH-SY5Y細胞源于人的神經母細胞瘤SK-NSH細胞系［17］，具有神經突樣的細胞質突起，表達多巴胺羥化酶和多巴胺轉運體及酪氨酸羥化酶，該細胞系被廣泛運用于PD發病機制的研究。MPTP的代謝產物MPP+作用于SH-SY5Y細胞可以作為研究PD發病機制的體外細胞模型。

在我們研究中，為探求Numb蛋白與α-syn蛋白的泛素化調控，首先利用細胞免疫熒光技術檢測Numb與α-syn蛋白的共定位，結果顯示二者存在亞細胞共定位。由于蛋白間存在復雜的相互作用，為進一步驗證Numb與α-syn的相互作用，我們分別將EGFP-N1或EGFP與HA-α-syn共同轉染后利用免疫共沉淀技術及Western-blot檢測，結果發現在過表達Numb的沉淀復合物中檢測到α-syn蛋白的存在，因此，可證實二者存在相互結合。之后，進一步研究Numb對α-syn寡泛素水平的調控，結果顯示，EGFP-Numb與HA-α-syn共同轉染后，通過Western blot檢測證實Numb上調了α-syn寡泛素化水平。最后，構建MPP+細胞模型，分別將EGFP-N1、EGFPNumb轉染SH-SY5Y細胞，利用細胞免疫熒光技術檢測內源性α-syn包涵體。結果顯示，與EGFP-N1組對比，EGFP-Numb組中過表達的 Numb促使MPP+誘導的α-syn包涵體的形成。

綜上所述，Numb蛋白上調α-syn蛋白的寡泛素化水平，并參與誘導α-syn包涵體的形成。這將可能有助于我們尋找阻斷Lewy小體形成的新的干預靶點，為帕金森病的早期治療提供新的手段。

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