依達拉奉對大鼠延髓缺血后神經元神經膠質細胞及微血管的影響

朱 江， 郭 森， 趙 亮， 高燕軍， 趙淑敏， 楊振軍

腦缺血后腦組織中自由基的過度產生導致的蛋白質及核酸的過氧化，是導致神經元、血管內皮細胞凋亡的主要因素。在腦缺血條件誘導下，延髓內部微血管、神經元、神經膠質細胞之間存在相互影響。依達拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)作為自由基清除劑近年來被研究者關注。臨床研究提示N-乙酰門冬氨酸(NAA)是特異性的存活神經細胞的標志，腦缺血發病初期含量急劇減少。本實驗將依達拉奉應用于實驗模型中，利用其清除自由基，抑制脂質過氧化的藥理作用，探討自由基清除劑對大鼠延髓缺血神經元、神經膠質細胞及微血管的保護作用。

1 材料和方法

1.1 動物與分組 SPF級Wistar成年健康雄性大鼠，200～220 g，購于河北醫科大學實驗動物中心。108只大鼠隨機分為3組:假手術組，實驗組，缺血對照組。按時間點分為7 d、14 d兩個亞組，其中電鏡組每組6只，其余每個亞組12只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 延髓缺血模型制備 結扎右側頸總動脈:10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出右側頸總動脈并結扎切斷，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動脈:大鼠俯臥固定，于后正中線第一頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第1頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入橫突孔內凝閉椎動脈3～4 s，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養。

1.2.2 實驗動物的干預方法 假手術組只暴露雙側椎動脈及右側頸總動脈，不做血管阻斷處理。實驗組、缺血對照組均在阻斷雙側椎動脈及右側頸總動脈后立即開始治療。實驗組每天腹腔注射依達拉奉二次，時間間隔12 h，每次注射計量按3 mg/kg計算，到術后7 d和14 d兩個時間點分別處死，取延髓。缺血對照組每天腹腔注射生理鹽水兩次，時間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。到術后7 d和14 d兩個時間點分別處死，取延髓。

1.2.3 實驗標本制作 應用10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心臟，用連有輸液管的預先處理為鈍圓的針頭插入左心室內，快速輸入溫生理鹽水(37℃)100 ml，同時用眼科剪剪破右心耳，此時血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛(0.1 mol磷酸鹽緩沖液配成pH 7.4)灌流固定。灌流結束后取出延髓，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.2.4 電鏡標本的制作 將取得的標本切成1 ×1 ×1 mm3的小塊，25%戊二醛固定4h，0.1 mol/L的PBS沖洗3次，每次5 min，1%鋨酸固定1.5 h，0.1 mol/L的 PBS漂洗 12 h，丙酮梯度脫水，Epon812浸透包埋，超薄切片，鈾鉛染色。

1.2.5 神經元、神經膠質細胞的細胞計數及定量分析 每只大鼠取4張切片，每張切片在200倍光鏡下隨機選取5個視野，輸入醫學顯微圖像分析系統(MiVnt)進行圖像處理，計數神經元、神經膠質細胞，取其平均值為這只大鼠的神經元、神經膠質細胞的細胞數。

1.2.6 單寧酸-氯化鐵媒染法觀察微血管密度的變化 每只大鼠取3張切片，采用Mivnt圖像分析系統定量分析延髓微血管密度(microvesser density，MVD)和微血管面積比(microvesser aera density，MVA)。每張切片在100倍光鏡下選5個視野，分別計算MVD值和MVA值，取平均值作為該只大鼠延髓微血管的MVD值和MVA值。

1.2.7 統計學處理 用SPSS13.0統計軟件包處理，數據用均數±標準差(χ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦組織中神經元數量的變化 通過對7 d、14 d后實驗動物的觀察，實驗組及缺血對照組中神經元的數量較假手術組明顯減少。同時，實驗組神經元減少的幅度較缺血對照組減少的幅度低。實驗組中神經元數量較缺血對照組數量增加。與假手術組相比較有統計學差異(見表1)。

2.2 各組腦組織中神經膠質細胞數量的變化通過對7 d、14 d后實驗動物的觀察，實驗組及缺血對照組中神經膠質細胞的數量較假手術組顯著增加。但是，實驗組神經膠質細胞增加的程度低于缺血對照組神經膠質細胞增加的程度。其中，實驗組各時段神經膠質細胞數量均低于缺血對照組數量。與假手術組比較有統計學差異(見表2)。

2.3 各組腦組織中微血管密度(MVD)和微血管面積比(MVA)的變化 通過對7 d、14 d后實驗動物的觀察，實驗組及缺血對照組的微血管密度(MVD)值較假手術組均減少。實驗組數值減少的幅度低于缺血對照組。其中，實驗組MVD值在各時段均高于缺血對照組。實驗組及缺血對照組的微血管面積比(MVA)值均低于假手術組。實驗組數值減少的程度較缺血對照組低。其中，實驗組MVA值在各時間段均高于缺血對照組。與假手術組相比較二者均有統計學差異(見表3、表4)。

2.4 各組腦組織中組織學觀察 在假手術組中，神經元胞體中央有大而圓的細胞核，核仁大而明顯，胞體的細胞質內含有發達的粗面內質網、游離核糖體、高爾基復合體等。粗面內質網呈規則平行排列。游離核糖體分布于其間。神經元尼氏體豐富。線粒體膜完整，線粒體嵴清晰。神經膠質細胞有序排列在神經元周圍。微血管內皮相互連續，基膜完整。缺血對照組實驗7 d時，可觀察到神經元數量減少，核固縮、碎裂、溶解，膜結構模糊。細胞核內有核袋及假包涵體形成。核仁偏位，核膜內陷。線粒體體積較前增大，質地變空，線粒體嵴變短。粗面內質網脫顆粒。神經膠質細胞數量較前增加，排列緊密，核仁明顯。微血管閉塞，數量減少，膜結構不清晰。實驗14 d時可觀察到，神經元數量較前進一步減少，神經元溶解消失，細胞器破壞明顯。神經膠質細胞增加明顯，細胞較大，核較小。微血管數量較前有所增加。實驗組中神經元數量較缺血對照組數量多，核固縮、破裂、溶解的程度較缺血對照組程度輕。實驗組較缺血對照組壞死區域面積小，且局部填充的膠質細胞數量少。實驗組中微血管閉塞數量較缺血對照組少，血管內皮腫脹程度低，膜結構較清晰。

表1 各組大鼠腦組織中神經元數量比較(χ±s)

表2 各組大鼠腦組織中神經膠質細胞數量比較(χ±s)

表3 各組大鼠腦組織中MVD含量的比較(χ±s)

表4 各組大鼠腦組織中MVA含量比較(χ±s)

3 討論

延髓內部包含大量神經元，神經元周圍有神經膠質細胞填充。正常生理情況下，神經元、神經膠質細胞和毛細血管緊密結合在一起［1］。延髓中有大量神經纖維通過，是聯系大腦、小腦、脊髓的生命中樞，因此，研究延髓缺血具有其重要性、必要性。

在延髓缺血后，出現神經元數量及微血管密度的減少，神經膠質細胞數量的增加。在缺血條件下，神經膠質細胞大量增生填充于壞死區域，從而影響到微循環，引起局部微循環障礙。進一步加重神經元的缺血，出現大量神經元胞體凋亡。自由基在腦缺血缺氧損傷過程中起著關鍵性作用，自由基對腦組織的損害是通過和缺血缺氧腦損害級聯反應機制中的興奮性氨基酸、鈣超載等彼此重疊、相互聯系的作用使脂質過氧化、膜功能損害、蛋白質、DNA、RNA損害最終形成炎癥、凋亡等病理過程實現的［2］。目前認為腦缺血后氧自由基增多是腦損傷加重的主要原因，依達拉奉作為一種新型自由基清除劑，抑制脂質過氧化作用、抑制腦細胞過氧化，從而減輕腦缺血引起的組織損傷［3］，也能防止氧化性細胞損傷，減少缺血半暗帶面積，可減輕血管內皮細胞損害［4］，從而抑制遲發性神經元凋亡［5］。為腦缺血損傷提供保護作用［6］。研究表明，依達拉奉有直接清除NO、羥自由基及抗氧化活性作用［7］。同時依達拉奉可減少神經元NO合成酶和增加內皮型NO合酶，從而保護缺血損傷的神經元［8］。

通過本實驗結果可見，實驗組延髓組織的神經元減少的數量低于缺血對照組，提示依達拉奉可通過清除自由基而保護神經元。實驗組神經膠質細胞增加的數量較缺血對照組數量低，實驗組中延髓組織內微血管密度較缺血對照組高。說明依達拉奉在延髓缺血過程中通過清除自由基，減輕了腦組織損傷。隨著時間的延長，盡管應用依達拉奉干預治療，但神經元數量仍在減少，神經膠質細胞數量仍有增加。考慮依達拉奉可減輕內源性自由基的產生，提示在治療上應盡早用藥。

本實驗結果提示，延髓缺血后由于自由基產生，使延髓內部微血管、神經元、神經膠質細胞相互影響，出現病灶局部微循環改變，出現遲發性神經元死亡，缺血腦組織損傷加重。依達拉奉通過清除自由基，減輕血管內皮細胞損害，改善了微循環障礙，發揮了對神經細胞的保護作用。

［1］劉斌主編.組織學與胚胎學［M］.北京:北京大學出版社，2003.12-25.

［2］Yuki S，Kogue K.The changes of LCGU and rCBF in the MCA occlusion-recirulation model in rats and ameliorating effect of MCI-186，a novel free radical scavenger［J］.Mol Chem Neuropathol，1997，32(1～3):123-128.

［3］王永生.依達拉奉在腦缺血再灌注損傷保護作用機制的研究［J］.藥物與臨床，2011，18:48-51.

［4］Tanahashi N，Fukuuchi Y.Treatment of acute ischemic stroke recent progress［J］.Internal Medicine，2002，41(5):337-343.

［5］Jain KK.Neuroprotection in cerebrovascular disease［J］.Exp Opin Invest Drugs，2000，9(4):695-711.

［6］李 昭，趙 彬.依達拉奉對急性腦梗死患者血清超氧化物歧化酶、丙二醛的影響及療效分析［J］.沈陽醫學院學報，2008，10:27-29.

［7］Satoh K，Ikeda Y，Shioda S，et al.Edaravone scavenges nitric oxide［J］.Redox Rep，2002，7:219-223.

［8］Takahashi G，Sakurai S.MCI-186 prevents spinal cord damage and affects enzyme levels of nitric oxide synthase and Cu/Zn superoxide dismutase after transient ischemia in rabbits［J］.JThorac Cardiovasc Surg，2003，126:1461-1465.