慢性酒精中毒對清醒大鼠相關腦區部分氨基酸含量變化的影響

鄭雪梅， 許銀花， 金東春， 崔松彪， 吳 光

酒精的主要成分為乙醇，為親神經物質，是目前最常見的神經毒性藥物。乙醇攝入體內后分布于所有的組織和體液中，對其可產生多方面的破壞作用。對乙醇成癮是酒精中毒的一個主要特征，長期反復飲酒可產生慢性中毒。

本實驗采用慢性酒精中毒大鼠自由飲模型，利用高效液相色譜法及腦內微透析采樣技術在大鼠清醒狀態下測定慢性酒精中毒時蒼白球腹側核和中腦腹側被蓋區細胞外液中部分氨基酸類神經遞質的含量，觀察慢性酒精中毒時蒼白球腹側核和中腦腹側被蓋區氨基酸含量變化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 實驗選用成年Wistar雄性大鼠40只，體質量(370±30)g，隨機分成對照組、6%酒精組、8%酒精組、12%酒精組，每組各10只，由延邊大學醫學部實驗動物科提供。模型組大鼠單籠飼養，連續自由飲含低濃度乙醇(6%、8%、12%)的水溶液4 m，建立慢性酒精中毒動物模型。適應階段，按酒精濃度從低到高，經過7 d達到設計酒精濃度:6%酒精組每2 d遞增1.5%(1.5%→3%→4.5%→6%)，以后維持在6%的水平至造模結束;8%酒精組每2d遞增2%(2%→4%→6%→8%)，以后維持在8%的水平至造模結束;12%酒精組每2 d遞增3%(3%→6%→9%→12%)，以后維持在12%的水平至造模結束。模型組以含各濃度乙醇的水溶液作為大鼠唯一飲水來源，24 h自由飲，任意進食。造模期間大鼠死亡率為0%，對照組大鼠皮毛光澤，行動靈活，食量及大便正常，模型組大鼠在造模期間出現行動遲緩、睡眠多、情緒不穩等癥狀，進食量少于對照組，體質量增長較對照組緩慢，12%酒精組的變化尤為顯著。

1.2 手術方法 大鼠稱重，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，俯臥位固定于大鼠立體腦定位儀上，大鼠牙槽低于耳內切線3.3 mm。參照Bliss［1］等的方法進行腦部定位。根據 Paxinos和Watson［2］圖譜，將透析探針套管插入到蒼白球腹側核(VP)(前囟后0.26 mm，旁開2.5 mm，顱骨下8.4 mm)、中腦腹側被蓋區(VTA)(前囟后6.04 mm，旁開0.5 mm，顱骨下8.7 mm)。術后，待動物狀態恢復正常時，將透析導管(作用透析膜1.0 mm)插入透析套管內，待收集灌流液。

1.3 腦部微量透析及樣本收集 動物術后當天微量透析探針連接微量泵，以1.5μl/min速度向大鼠VP區灌流Ringer’s液，穩定30 min，同時經樣本收集器連續收集樣本3管，每管收集10 min，收集量為15μl。隨后收集VP區樣本，并使用相同方法收集VTA區樣本，再次收集灌流液3管，-80℃冰箱中冷凍保存，以備進行氨基酸含量的分析。

1.4 氨基酸含量分析方法 參照Jin等方法［3］配制衍生劑1溶液和衍生劑2溶液。取收集好的樣本12μl和4 mmol/L的OPA溶液在室溫下反應2.5 min，抽取反應液10μl，注入到生物活性物質微量分析系統(日本Eicom公司產)。以0.5 ml/min速度通過高效液相分離柱(SC-50DS)和電化學檢測器(ECD-300)測定樣本中氨基酸的含量。每次樣本分析均以稀釋的氨基酸標準液(2 ml)作為基礎。

1.5 統計學方法 數據以均值±標準差(χ±s)表示，用SPSS11.5統計軟件包進行了t檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性酒精中毒對大鼠VP區氨基酸的影響 與正常組相比，6%酒精組大鼠細胞外液Gly、Tau、Ala含量增高(P＜0.05);12%酒精組大鼠細胞外液Gln、Asp含量明顯減少(P＜0.01)(見表1)。

2.2 慢性酒精中毒對大鼠VTA區的氨基酸的影響 與正常組相比，6%酒精組大鼠細胞外液Asp含量明顯增高(P＜0.01);12%和8%酒精組大鼠細胞外液 Asp、Glu、Ala、Gly、Gln 含量均增高，而 Tau含量在VTA區無明顯變化(見表2)。

表1 VP區氨基酸的變化(χ ± s，n=10)

表2 VTA區氨基酸的變化(χ ± s，n=10)

3 討論

中腦-邊緣系統多巴胺神經元與乙醇依賴的關系極為密切，多巴胺參與獎賞和增強等神經機制，乙醇則優先增強腦區多巴胺釋放［4］。現在更多的研究發現該神經通路還與成癮渴求和復發有關。VTA多巴胺神經元投射到邊緣系統有關腦區的通路，成為中腦-邊緣多巴胺系統，中腦-邊緣系統中多巴胺獎賞回路中主要組成部分中一些神經元可投射到蒼白球(VP)或通過VP投射到其它腦區［5］，故本實驗測定清醒自由狀態下的慢性酒精中毒大鼠VP區及VTA區細胞外液中的部分氨基酸類神經遞質含量的變化。

既往研究神經遞質的變化多采用離體勻漿法分析，測定出來的是一種靜態的、混雜的結果，它代表細胞內和細胞外的物質含量總和。但目前多利用比較先進的對神經細胞間隙(細胞外液)進行動態檢測來測定神經遞質含量的變化，即腦內微透析取樣技術。所謂腦內微透析取樣技術是一種連續灌注并采集活體動物特定腦區內灌流液的新方法，其優點是透析液中不含有大分子物質，如蛋白質、酶等等，取樣無需勻漿，避免了復雜的采樣前處理過程，可真實代表取樣位點目標化合物的濃度;并且對腦組織的損傷非常輕微，因此廣泛應用于定量分析大腦細胞外液中的各種神經遞質的濃度變化［6］，微透析取樣技術和微量化學分析技術結合可精確測定動物在清醒狀態下的特定腦區的神經遞質濃度變化情況。

神經元之間的信息交流主要是通過化學傳遞來完成，中樞神經系統內大部分信息交流是以神經遞質釋放、與受體結合而引發生理效應的方式來進行。氨基酸是中樞神經系統數量最多、分布最廣的神經遞質，它們不僅具有代謝作用，還作為神經遞質對維持正常的腦功能起著重要作用，根據作用可分為兩大類，即興奮性氨基酸遞質，如谷氨酸、天冬氨酸;抑制性氨基酸遞質，為甘氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、牛磺酸等等。近年來通過很多研究發現，腦缺血時細胞外液興奮性和抑制性氨基酸遞質均增高。興奮性氨基酸是一種神經毒素，在細胞外液堆積產生興奮毒性作用，腦缺血時抑制性氨基酸遞質釋放也反應性上升以維持興奮性和抑制性氨基酸遞質的動態平衡［7］，以此對抗興奮性氨基酸的毒性作用。本實驗研究結果顯示，長期低濃度給予酒精時，VTA區興奮性氨基酸和抑制性氨基酸均增高，如12%和8%酒精組大鼠細胞外液 Asp、Glu、Ala、Gly、Gln含量均增高，故我們可推測慢性酒精中毒時大鼠VTA區中有兩類不同氨基酸神經遞質共同參與，這一結果與許銀花［8］等研究的急性酒精中毒時大鼠海馬 DG區Asp、Glu和Gly含量增加的結果類似，但6%酒精組僅使興奮性氨基酸如Asp、Glu含量增高，這可能與大鼠飲酒量、飲酒時間及飲酒濃度有關。VP區6%酒精組大鼠細胞外液 Gly、Tau、Ala含量增高;而12%酒精組大鼠細胞外液Asp、Gln含量明顯減少，這可能破壞了氨基酸的動態平衡，Faigold等研究證實長期反復飲酒可導致腦內興奮性氨基酸和抑制性氨基酸的失衡［9］，故對機體產生不良影響。

綜上所述，慢性酒精中毒與蒼白球腹側核區Gly、Tau、Ala含量增加有關;與蒼白球腹側核區Gln、Asp含量減少有關;并且與中腦腹側被蓋區Asp、Glu、Ala、Gly、Gln含量增加有關。本實驗應用慢性酒精中毒大鼠自由飲模型，選用了與多巴胺能神經元功能關系密切的VP及VTA區，研究長期飲酒后腦內部分氨基酸類神經遞質含量變化，為臨床預防乙醇對人體的損害提供理論依據和實驗基礎。

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