中藥蟾酥活性成分抗腫瘤作用研究進展*

姜偉奇

(上海中醫藥大學科技中心病毒與免疫實驗室， 上海 201203)

蟾酥一詞源于《本草衍義》屬名貴中藥，為蟾蜍科動物中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)等的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液，經加工干燥制成。主要產于中國河北、山東、江蘇、浙江等地。本品性味甘辛、溫、有毒，近年研究證明，蟾酥不僅可以鎮痛、消炎、麻醉，還有抗癌、抗輻射、強心等多種生物活性[1，2]。由于蟾酥在臨床治療癌癥方面具有確切藥理活性，引起國內外學者廣泛關注。本文將對蟾酥的化學成分和有關抗腫瘤作用加以綜述，旨在為蟾酥的開發利用提供參考。

1 蟾酥的化學成分

蟾酥的化學成分比較復雜，現代藥理研究發現蟾酥中主要含有多種強心甾體類化合物。通過對蟾酥的分離和鑒定，目前已確定其主要化學成分按結構分類如下[3-5]：(1)強心甾體類化合物，可分為：蟾毒配基類(bufogenins，BGs)、脂蟾毒配基(resibufogenin，RBG)、華蟾毒配基(cinobufagin，CBG)、遠華蟾毒配基(telocinobufagin，TCBG)、蟾毒靈(bufalin，BL)、華蟾毒它靈(cinobufatalin)、日蟾毒它靈(gamabufotalinin)及南美蟾毒精等。(2)吲哚類生物堿及其衍生物，此類化合物含有吲哚環，是具有一定生物活性的水溶性吲哚生物堿，包含：蟾酥堿、蟾酥甲堿、5-羥色胺、去氫蟾酥堿等。(3)甾醇類，蟾酥含有膽甾醇、7α-羥基膽甾醇、7β-羥基膽甾醇、β-谷甾醇、麥角甾醇等。(4)其他類：近年來新發現的幾種成分，有20，21-環氧蟾毒內酯、20S，21-環氧蟾毒配基、20R，21-環氧蟾毒配基、3-O-甲羧基-20S，21環氧蟾毒配基、3-O-20S，21-環氧蟾毒配基；蟾酥中尚含有腎上腺素及多種氨基酸。

目前研究表明，蟾酥及其活性成分具有抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡等作用。其中以有脂蟾毒配基、蟾毒靈和華蟾毒配基類化合物被認為是蟾酥抗腫瘤作用的主要活性成分。

2 蟾酥的抗腫瘤作用

近年來有研究報道，蟾酥及其制劑可抑制腫瘤細胞生長并能誘導腫瘤細胞凋亡，因而成為抗腫瘤藥物研發的熱點。蟾酥誘導細胞凋亡需要多種信號通路的調節，如線粒體途徑、死亡受體途徑、凋亡相關蛋白，如bcl-2，survivin，bax，p53基因和caspase蛋白等。其在蟾酥不同活性成分誘導的腫瘤細胞凋亡中發揮重要的作用。

2.1 蟾酥對白血病細胞的作用 Zhu等[6]研究表明蟾毒靈能以劑量時間依賴的方式抑制人急性早幼粒白血病NB4細胞增殖并誘導其發生凋亡，蟾毒靈協同MEK抑制劑PD98059作用于NB4細胞后能夠下調survivin的表達，并促進caspase-3的活化。說明蟾毒靈誘導NB4細胞凋亡過程中與survivin 基因表達下調有關。在蟾毒靈誘導的人白血病細胞株HL-60凋亡過程中，Bcl-2表達水平降低的同時發生了Bcl-2的裂解。HL-60細胞中存在磷酸化的Bcl-2，在蟾毒靈誘導細胞凋亡的過程中，Bcl-2表達下調的同時磷酸化水平降低，即發生脫磷酸化。蟾毒靈短時間處理后，蛋白激酶C(PKC)總活性沒有明顯變化，但PKCβⅡ發生快速膜轉位，隨后出現了Bcl-2的脫磷酸化。表明蟾毒靈導人類白血病HL-60細胞凋亡的機制可能與Bcl-2表達下調、裂解及脫磷酸化有關，并且PKCβⅡ發生的膜轉位活化可能參與了Bcl-2的脫磷酸化[7，8]。曲秀娟等[9]在研究SYK和Cbl家族蛋白在蟾毒靈誘導HL-60細胞凋亡過程中的作用機制發現蟾毒靈作用于HL-60細胞后，SYK蛋白快速被磷酸化，并以時間劑量依賴的方式下調Cbl和Cbl-b的表達，提示這可能也是蟾毒靈誘導細胞凋亡分子機制之一。劉云鵬等[10]在研究蟾毒靈誘導人白血病細胞株K562細胞分化和凋亡中發現，在細胞分化早期和細胞凋亡發生前，蟾毒靈明顯下調K562細胞WT1 mRNA和蛋白的表達，提示蟾毒靈誘導K562細胞向單核巨噬細胞分化和細胞凋亡可能與其對WT1的下調有關。盛秀勝等[11]還發現華蟾素能濃度依賴的抑制K562細胞生長，并通過流式細胞術分析發現華蟾素誘導K562細胞凋亡，其機制與提高Caspase-3表達有關。

2.2 蟾酥對乳腺癌細胞的作用 Yan等[12]利用MTT法檢測蟾毒靈對人腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的細胞增殖活力，發現蟾毒靈對這2種細胞的增殖都有明顯的抑制作用并且呈時間劑量依賴。運用western blot，反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)等技術測定細胞中DR4和DR5基因mRNA的含量，從而判定細胞中DR4和DR5基因的表達水平，又利用caspase活性檢測和siRNA轉染技術檢測caspase-8的活化和PARP的裂解來進一步探討蟾毒靈與TARIL誘導細胞凋亡協同效應的分子機制。實驗證明了在MCF-7和MDA-MB-231細胞中蟾毒靈能增強TARIL通過激活外源性凋亡途徑誘導的細胞凋亡并且蟾毒靈作用于細胞后與對照組相比DR4和DR5的表達顯著上調。同時研究證明蟾毒靈能上調DR4和DR5的表達是通過激活ERK、JNK和P38MAPK途徑并且下調Cbl-b實現的。Ma等[13]研究華蟾毒精誘導MDA-MB-231細胞凋亡的機制發現華蟾毒精能夠以劑量時間依賴的方式抑制MDA-MB-231細胞的增殖，當用50μg/ml的華蟾毒精作用于細胞48 h后，早期細胞凋亡率與對照組相比有顯著性差異，細胞周期阻滯在S期。利用原子力顯微鏡觀察到華蟾毒精能破壞細胞骨架改變細胞表面超微結構和細胞形態。為進一步研究華蟾毒精誘導細胞凋亡的分子機制提供新的思路。

2.3 蟾酥對肺癌細胞的作用 肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。非小細胞肺癌約占肺癌病例的80～85%，其中大部分患者被診斷時已經是晚期[14]。有研究證實[15～16]在體外實驗條件下，采用不同濃度的蟾毒靈作用于A549細胞后，發現蟾毒靈能抑制細胞增殖，且呈劑量時間依賴。通過Western blot檢測相關蛋白的表達，結果顯示蟾毒靈可以抑制Akt的活化，蟾毒靈與Akt抑制劑聯合作用于A549細胞后能誘導其凋亡，并能上調Bax的表達，下調Bcl-2和livin的表達，進一步活化caspase-3。提示蟾毒靈誘導A549細胞凋亡是通過抑制PI3K/Akt途徑實現的。陳同生等[17]采用基因質粒轉染技術、熒光發射譜檢測分析以及熒光共振能量轉移(FRET)受體光漂泊技術，首次在活細胞中實時檢測蟾酥誘導人肺腺癌(ASTC-a-1)細胞凋亡過程中caspase-3的活化特性。采用CCK-8技術檢測發現，蟾酥可以有效抑制ASTC-a-1細胞的增殖活性并具有劑量依賴性。用蟾酥處理穩定表達FRET質粒SCAT3的人肺腺癌ASTC-a-1細胞，采用熒光發射譜檢測分析以及熒光共振能量轉移受體光漂白技術，2h后明顯觀察到活化的caspase-3將SCAT3切割為兩部分，并且SCAT3的切割程度隨著蟾酥作用時間的延長而增加，24 h內細胞內的SCAT3完全被切割。表明caspase-3 參與調控了蟾酥誘導的細胞凋亡過程。Sun[18]等研究發現，當蟾毒靈作用于人肺腺癌ASTC-a-1 細胞時可以產生大量活性氧，同時增強caspase-3 活性，促使凋亡蛋白Bax 從細胞質向線粒體移位，從而誘導ASTC-a-1 細胞凋亡。

2.4 蟾酥對肝癌細胞的作用 Qi等[19]發現蟾毒靈和華蟾毒精能顯著改變肝癌細胞株HepG2凋亡形態，使凋亡細胞數量顯著增加。其誘導細胞凋亡的途徑與上調Fas、Bax、Bid的表達，抑制Bcl-2蛋白表達，同時降低線粒體膜電位，釋放細胞色素C，活化Caspase-3，8，9，10有關。提示蟾毒靈和華蟾毒精誘導細胞凋亡的機制主要是通過Fas和線粒體途徑介導的。另有研究表明蟾毒靈作用于HepG2后可使細胞周期阻滯在G2/M期通過下調Aurora A、CDC25、CDK1、cyclin A并上調p53和p21蛋白的表達，同時降低線粒體膜電位使細胞內Ca水平和活性氧的產生增加，活化caspase-9和caspase-3[20]。

肖義秀等[21]通過流式細胞術檢測發現脂蟾毒配基能誘導人肝癌細胞Bel-7402發生凋亡，其凋亡率超過50%，呈劑量依賴。脂蟾毒配基作用于Bel-7402后，Bax蛋白表達增加，對細胞凋亡的產生具有促進作用，并與Bcl-2蛋白表達的下降有協同作用。黃應申等[22]通過流式細胞術和Western Blot等實驗方法研究發現脂蟾毒配基還可引起線粒體跨膜電位下降，細胞色素C釋放增多，活化Caspase-3，同時抑制Bcl-2蛋白表達，誘導細胞凋亡。

2.5 蟾酥對胃癌細胞的作用 Li等[23]實驗結果顯示蟾毒靈能劑量和時間依賴性的抑制胃癌細胞株MGC803的增殖，在低濃度為20 nmol/l下蟾毒靈可誘導細胞周期阻滯在M期。在高濃度80 nmol/l下能誘導細胞凋亡。一方面可能與下調Bcl-2的表達，降低Bcl-2/Bax比值并活化caspase-3有關。另一方面，研究中還發現蟾毒靈能瞬時激活PI3K/Akt信號通路隨后再將其完全抑制，上調Cbl的表達，這些結果表明PI3K/Ak通路可能在蟾毒靈誘導胃癌MGC803細胞凋亡過程中發揮關鍵作用。孟書聰等[24]利用流式細胞術檢測細胞周期、細胞凋亡率及其線粒體膜電位變化；Western blot檢測與細胞凋亡相關基因蛋白表達的變化。實驗證明脂蟾毒配基能顯著抑制細胞生長，且呈劑量時間依賴。低劑量作用時間為24～48 h，將細胞阻滯在S期，處于G2/M期的細胞數量少，隨作用時間延長阻滯細胞在G2/M 期。脂蟾毒配基引起細胞線粒體膜電位下降，釋放到胞質中的細胞色素C增多，促進caspase-3活化，抑制Bcl-2的表達，誘導細胞凋亡。進一步表明脂蟾毒配基可誘導人胃癌BGC-823細胞發生凋亡，其誘導凋亡作用機制與線粒體通路有關。

2.6 蟾酥對宮頸癌細胞 Cao等[25]研究發現當用10-8M的蟾毒靈作用于人宮頸癌Hela細胞時，細胞凋亡程度具有時間依賴性。而且細胞中Tiam1蛋白含量開始增加，在30 min后達到最大表達量，隨著時間的延長Tiam1蛋白表達水平逐漸下降。提示Taim1蛋白在蟾毒靈誘導的Hela細胞凋亡中發揮重要作用。王鸝等[26]采用MTT法和流式細胞術等實驗方法研究華蟾毒精抑制Hela細胞增殖作用機制，結果表明華蟾毒精對Hela細胞的增殖有顯著的抑制作用。可使細胞周期阻滯在G2/M期，并對Hela細胞內相對分子質量較小的酸性蛋白表達有明顯的影響。Emam等[27]研究結果顯示，華蟾毒它靈作用于Hela細胞后，線粒體膜電位下降，細胞內鈣離子和活性氧的產生增加。此外，華蟾毒它靈能上調Fas、Bid、Bax的表達并活化細胞色素C和caspase-2，-3，-8，-9，提示華蟾毒它靈誘導Hela細胞凋亡主要是通過Fas和線粒體途徑介導的。

3 小結

蟾酥在中國的用藥歷史悠久，具有較強的藥理活性，受到研究者的廣泛關注。近年來的研究結果已經證實蟾酥及其活性成分對于白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等腫瘤細胞具有有效的抗癌活性。但蟾酥作為藥物使用可導致頭暈、惡心、抽搐甚至死亡[28]。這些毒副作用加大了臨床使用風險，不適合長期連續服用。因此，要加強臨床前的實驗研究，確定臨床有效的用藥劑量，提高臨床用藥的安全性和有效性。蟾酥成分復雜，目前的研究表明，蟾酥不同活性成分發揮抗腫瘤作用具有多靶點的特征。因此，需充分利用現代分子生物學技術全面深入的闡明蟾酥活性成分抗腫瘤的作用機制，為研制出高效低毒的抗癌藥物提供理論依據。

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