姜黃素通過(guò)抑制NF-κB的活化增加胃癌細(xì)胞的放療敏感性

吳 宏，閆國(guó)誠(chéng)，王雙全，王 凱，張 毅

(1西電集團(tuán)醫(yī)院普外科，西安 710007;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科;*通訊作者，E-mail:wuhongg666@163.com)

胃癌是普外科常見(jiàn)腫瘤之一，胃癌的治療除手術(shù)治療外，放射治療也是重要的治療方法之一，但由于放療耐受的發(fā)生，其治療效果一直不甚理想。開(kāi)發(fā)新的放療增敏劑，提高患者放射治療的療效，成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)之一。中藥因其作用廣泛、毒副作用較低，成為放療增敏劑的重要選擇方向之一，因此，許多研究將目光投到了中藥領(lǐng)域，其中就包括姜黃素［1－3］。

姜黃素是姜黃根莖中的主要有效成分，其為一種多元酚。既往研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抗增殖、促凋亡、抗血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯等多種功能［4－11］。也有研究發(fā)現(xiàn)其具有放療增敏作用［3］，但是其具體分子機(jī)制尚未明確。基于以上背景本實(shí)驗(yàn)選擇觀察姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞的放療增敏作用，探討其具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

姜黃素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，使用二甲基亞砜(DMSO)溶解制成10 mmol/L的儲(chǔ)存液備用。人胃癌細(xì)胞株(BGC-823)為本實(shí)驗(yàn)室保有，細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兔抗人p65抗體，兔抗人p50抗體，兔抗人AKT抗體，兔抗人p-AKT抗體購(gòu)自美國(guó)Cellsignal公司，抗β－actin抗體及羊抗人Histone H1購(gòu)自美國(guó)Santa公司。

1.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823增殖的影響

利用MTT方法檢測(cè)姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823增殖的影響。將細(xì)胞接種于96孔板中每孔接種細(xì)胞大約3×103個(gè)(細(xì)胞計(jì)數(shù)法)，培養(yǎng)過(guò)夜，次日吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，用含有不同濃度姜黃素(0，10，20，30，40，50，60 μmol/L)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后利用MTT法檢測(cè)。根據(jù)每組細(xì)胞數(shù)占DMSO干預(yù)組個(gè)數(shù)百分比對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞放療敏感性的影響

將胃癌細(xì)胞系BGC-823分為兩組，對(duì)照組利用DMSO進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)組利用25μmol/L的姜黃素進(jìn)行處理。4 h后室溫條件下接受照射(放射量分別為0，2，4，6 Gy)，然后吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，洗滌細(xì)胞兩次，將細(xì)胞重懸后接種于60 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)10－14 d后結(jié)晶紫染色后計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆。

1.4 Western blot檢測(cè)姜黃素對(duì)p65、p50、AKT 和p-AKT表達(dá)的影響

將胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞分為三組0，25，50 μmol/L姜黃素干預(yù)組，每組都接受4 Gy的射線照射。處理方法同克隆形成實(shí)驗(yàn)。然后收集細(xì)胞按以下方法提取蛋白。

1.4.1 總蛋白提取 將1×106個(gè)單細(xì)胞懸液裂解于200μl細(xì)胞裂解液中，充分裂解后低溫離心，上清即為細(xì)胞總蛋白。

1.4.2 胞核蛋白提取 方法參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行(南京凱基)，具體如下:取培養(yǎng)細(xì)胞5×106－1×107個(gè)/ml，4 ℃離心，500×g，3 min 后收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗滌兩遍;移液槍盡可能取去上清，勿留殘液，估計(jì)細(xì)胞壓積PCV(離心后的緊實(shí)細(xì)胞體積);每20μl細(xì)胞壓積中，加入200μl預(yù)冷的Buffer A，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩15 s，置冰上10－15 min;加入11μl冷Buffer B，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩5 s，置冰上1 min;再次最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩5 s后，4 ℃離心，16 000×g，5 min;盡快將上清轉(zhuǎn)入另一預(yù)冷的潔凈微量離心管，置于冰上，即得胞質(zhì)蛋白;在離心沉淀物中加入100μl預(yù)冷的Buffer C，再次離心，即可得到胞核蛋白。蛋白采用BCA試劑盒進(jìn)行定量。提取蛋白定量后每孔取50μg上樣，其后進(jìn)行凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗(抗 p65 抗體 1∶500，抗 p50 抗體 1∶600，抗 AKT抗體1∶1 000，抗p-AKT 抗體1∶1 000，β－actin抗體1∶1 000，抗Histone H1 抗體1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，相應(yīng)二抗常溫孵育2 h，加入發(fā)光液用上海培清凝膠酶譜成像儀檢測(cè)蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC－823細(xì)胞增殖能力的影響

隨著姜黃素作用濃度的增加，姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞的增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，其作用表現(xiàn)出明確的劑量效應(yīng)關(guān)系，在濃度高于40 μmol/L時(shí)，這種作用更為強(qiáng)烈，與空白對(duì)照濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1)。

圖1 姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞株系BGC-823增殖能力的抑制作用Figure 1 The anti-proliferative effect of curcumin on gastric cell lines BGC-823

2.2 姜黃素處理后細(xì)胞的放療敏感性明顯增加

根據(jù)MTT的相關(guān)結(jié)果，我們選用25μmol/L作為姜黃素的干預(yù)劑量(對(duì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯的抑制作用)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為兩組:空白對(duì)照組(0 μmol/L)和姜黃素干預(yù)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)姜黃素處理后，空白對(duì)照組細(xì)胞存活率隨放射劑量的增加逐漸降低，而姜黃素干預(yù)組隨放射劑量的增加細(xì)胞存活率降低更加明顯，且兩組比較差異顯著(P＜0.05，見(jiàn)圖2)，即經(jīng)姜黃素處理后，照射后細(xì)胞克隆形成能力明顯降低，且隨著照射劑量的增加這種抑制作用更為明顯。

2.3 姜黃素抑制胃癌細(xì)胞系BGC-823中AKT的磷酸化水平及NF-κB的核內(nèi)表達(dá)水平

Western印跡法結(jié)果表明胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞核內(nèi)p65和p50的表達(dá)水平明顯降低(見(jiàn)圖3A)，利用Image J軟件測(cè)量各組數(shù)據(jù)的灰度值并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3B)。這提示NF-κB在姜黃素干預(yù)后入核的量與空白對(duì)照組相比明顯減低，姜黃素可能是通過(guò)抑制NF-κB的入核，從而阻斷其對(duì)下游基因的表達(dá)的調(diào)控來(lái)發(fā)揮其在胃癌細(xì)胞自BGC-823中的作用的。

此外我們的研究還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，姜黃素干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)總的AKT沒(méi)有變化，磷酸化的AKT明顯減少，并隨姜黃素濃度增加而減少(見(jiàn)圖4A)。利用Image J軟件測(cè)量各組數(shù)據(jù)的灰度值對(duì)各組p-AKT與AKT的比值占空白對(duì)照組百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖4B)，隨姜黃素濃度增加，磷酸化AKT百分比逐漸降低，提示，姜黃素可以抑制AKT的磷酸化。

圖2 姜黃素對(duì)放射治療后細(xì)胞的存活率影響Figure 2 Effect of curcumin on post-radiation cell clonogenic survival of gastric cells

圖3 照射后姜黃素抑制胃癌細(xì)胞系中p65和p50的核內(nèi)表達(dá)水平Figure 3 Curcumin inhibited the expressions of p65 and p50 in the nucleus after irradition

圖4 姜黃素對(duì)照射后胃癌細(xì)胞系中p-AKT和AKT表達(dá)水平的影響Figure 4 Effect of curcumin on the phosphorylation level of AKT after irradition

3 討論

胃癌是普外科最為常見(jiàn)的腫瘤之一，世界范圍內(nèi)占所有腫瘤總數(shù)的8%，占腫瘤致死總數(shù)的10%［12］。除外科手術(shù)治療之外，放射治療是胃癌術(shù)后重要的治療方法之一，但并不是所有的患者都對(duì)放射治療敏感，部分患者甚至出現(xiàn)明顯的耐受。臨床迫切需要解決這一難題，放療增敏劑的獲得便是解決這一問(wèn)題的重要途徑之一，目前中藥放射敏感性的研究較少，探索中藥在此方面的作用具有重要意義，姜黃素便是其中之一。在臨床應(yīng)用中姜黃素因?yàn)榫哂袃r(jià)格低廉、可口服且低毒性的特點(diǎn)，成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在達(dá)到12 mg/d的劑量時(shí)，人體仍可良好耐受，無(wú)明顯的毒副作用出現(xiàn)［13］。也有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)結(jié)腸癌具有預(yù)防作用且有效劑量較低［14，15］。本實(shí)驗(yàn)觀察姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823的放療增敏作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制胃癌細(xì)胞株BGC-823的增殖，在低于增殖抑制濃度的劑量具有明顯的放療增敏作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的活化與放射引起的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［16］。由于腫瘤細(xì)胞的凋亡與其放療敏感性密切相關(guān)，許多研究致力于明確NF-κB的活化與放療增敏的關(guān)系，多數(shù)研究認(rèn)為NF-κB的活化確與放療增敏密切相關(guān)，抑制NF-κB的活性能夠明顯提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性［17－21］。姜黃素作用范圍廣泛，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用涉及到多種分子及信號(hào)通路，我們推測(cè)其作用機(jī)制可能與NF-κB的活性改變相關(guān)，所以本實(shí)驗(yàn)將其列為研究的指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素能夠明顯抑制NF-κB的p65和p50亞基的入核，提示姜黃素可能是通過(guò)抑制NF-κB的入核進(jìn)一步作用下游靶基因，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞系BGC-823的放療敏感性。

AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最為常見(jiàn)的細(xì)胞信號(hào)通路之一，其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等均具有調(diào)節(jié)作用。此外研究發(fā)現(xiàn)AKT信號(hào)通路與腫瘤的放療增敏密切相關(guān)［22］，也有研究顯示，姜黃素對(duì)AKT信號(hào)通路的活性具有調(diào)節(jié)作用，姜黃素能夠抑制細(xì)胞內(nèi)AKT的磷酸化水平［23］。因此，我們推測(cè)姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞的放療增敏作用可能與AKT信號(hào)通路相關(guān)。本研究證實(shí)，姜黃素可以明顯抑制AKT信號(hào)通路的磷酸化水平。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞系的放療敏感性，而這種作用可能與其對(duì)NF-κB活性的抑制相關(guān)，而其對(duì)NF-κB活性的抑制可能與其對(duì)AKT的磷酸化水平的調(diào)節(jié)相關(guān)。本研究為姜黃素應(yīng)用胃癌的增敏治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為其在臨床中的應(yīng)用墊定了基礎(chǔ)。

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