Hsa-miR-106a在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

郭 波，王文靜，趙凌宇，常素娥，童東東，楊 陽(yáng)，宋土生，黃辰，3*

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系，西安 710061;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科;3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管研究中心;*通訊作者，E-mail:hchen@mail.xjtu.edu.cn)

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)2000年資料統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)胃癌876 000例，占所有新發(fā)癌癥病例的9%，僅次于肺癌、乳腺癌和腸癌，位居第4位。每年約有647 000人因胃癌死亡，位居癌癥死因的第2位［1］。我國(guó)是胃癌高發(fā)大國(guó)，約有35%的胃癌病例發(fā)生在中國(guó)，中國(guó)人群胃癌死亡率高達(dá)24.65/10萬(wàn)［2］。由于其惡性程度高、發(fā)病隱匿、病情進(jìn)展快、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性，且大部分胃癌患者臨床確診時(shí)已屬晚期，所以手術(shù)、放療、化療等各種治療方法效果均不佳，胃癌已成為威脅人類健康最難治療的疾病之一，且其發(fā)病率和死亡率呈逐年升高的趨勢(shì)。因此，研究胃癌的發(fā)生機(jī)制、尤其是胃癌發(fā)生過(guò)程中基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)尋找胃癌治療的新藥物，提高胃癌患者的預(yù)后具有重要意義。

微小RNA(microRNA)是一類進(jìn)化上高度保守的單鏈非編碼RNA小分子，由21－25個(gè)核苷酸組成，廣泛存在于真核生物中［3］。主要通過(guò)抑制mRNA翻譯或促進(jìn)其降解從而調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡，參與機(jī)體的發(fā)育、代謝以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等生物學(xué)過(guò)程，其與癌癥發(fā)生的關(guān)系更是癌癥研究新的熱點(diǎn)內(nèi)容［4］。因此，本研究采用real-time PCR方法檢測(cè)了hsa-miR-106a在胃癌組織及正常對(duì)照組織中的表達(dá)情況，以分析hsamiR-106a對(duì)胃癌發(fā)生機(jī)制、發(fā)展過(guò)程的影響，為探討胃癌發(fā)病機(jī)制和診斷治療的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

19對(duì)胃癌及正常對(duì)照組織(距離癌灶邊緣5 cm以上，病理證實(shí)為非腫瘤組織)標(biāo)本取自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011－03～2011－11間手術(shù)患者，平均年齡為(61.55±2.18)歲。所有患者均為原發(fā)性病灶切除，術(shù)前未經(jīng)放化療處理，簽署知情同意書(shū)。經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)后，對(duì)19例患者的臨床病理資料進(jìn)行整理分析。標(biāo)本采集后經(jīng)甲醛固定通過(guò)石蠟包埋進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

miRNA與內(nèi)參的反轉(zhuǎn)錄及real－time PCR引物序列由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)提供，引物合成由生工生物工程(上海)公司完成，序列見(jiàn)表1。

1.3 RNA的提取與鑒定

每個(gè)樣本的石蠟包埋組織取20μm厚度3－4張切片脫蠟，按石蠟組織試劑盒(RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit，USA，Ambion 公司)說(shuō)明書(shū)方法操作并檢測(cè)OD值，A260/A280比值均在1.8－2.2之間，為高純度 RNA，并調(diào)整 RNA濃度，置于－80℃保存。

表1 miRNA反轉(zhuǎn)錄與定量PCR引物Table 1 Primers for reverse transcription(RT)quantitative polymerase chain reaction of microRNAs and U6

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR

利用本實(shí)驗(yàn)已設(shè)計(jì)的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性RT引物，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。按試劑盒(PrimeScript? RT reagent Kit Perfect Real Time，JAP，TAKARA 公司)說(shuō)明反應(yīng)體系共10μl，RNA 約為40 ng，2μl 5×PrimeScript? Buffer，0.5 μl PrimeScript? RT Enzyme MixⅠ，1μl Reverse transcription引物，添加 RNase Free water調(diào)整體系至10μl。反應(yīng)條件37℃ 15 min，85℃ 5 s，反應(yīng)產(chǎn)物保存于4℃。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)，TAKARA)，反應(yīng)體系為20 μl:1 μl逆轉(zhuǎn)錄 PCR產(chǎn)物，10μl 2×SYBR? Premix Ex TaqTMII，上下游引物各1 μl，加 RNase Free water調(diào)整體系至20μl，設(shè)置U6做為內(nèi)參，每組樣本均做3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)在IQ－5型(Bio-Rad)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

讀取定量 PCR 反應(yīng) Ct值，計(jì)算 2－ΔΔCt(ΔCt=CtmiRNA-CtU6，microRNA 的相對(duì)表達(dá)量以 2－ΔΔCt計(jì))。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用單因素方差分析，比較miR-106a在不同臨床分期和病理分級(jí)胃癌中表達(dá)的差異，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 real-time PCR結(jié)果分析

將19對(duì)標(biāo)本一一對(duì)應(yīng)，分別計(jì)算出癌組織相對(duì)于正常對(duì)照組織的2－ΔΔCt，結(jié)果表明miR-106a在癌組織中有14例高表達(dá)，5例低表達(dá)(見(jiàn)圖1)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01，見(jiàn)圖2)。

圖1 miR-106a在19例胃癌組織中表達(dá)Figure 1 Expression of miR-106a in 19 cases of gastric cancer

圖2 miR-106a表達(dá)在胃癌組織中顯著高于正常組織Figure 2 Expression of miR-106a in gastric cancer and normal tissues

2.2 胃癌組織中miR-106a表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

分析結(jié)果顯示，在已獲得胃癌組織中miR-106a的表達(dá)量與腫瘤分化程度有相關(guān)性(P＜0.05)，但與年齡、性別、侵襲度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和病理分期等都無(wú)關(guān)(見(jiàn)表2)。

3 討論

胃癌的發(fā)生是一種多因素參與、多基因改變的事件，抑癌基因失活、DNA修復(fù)基因丟失、基因突變導(dǎo)致細(xì)胞周期改變、基因抑制細(xì)胞凋亡等均可導(dǎo)致胃癌發(fā)生，與胃癌相關(guān)的癌基因就多達(dá)400多種。已有研究證實(shí)，k-ras、p53 和e-Cadherin 基因的突變［5，6］，cmet、cyclin-E 以及 ERBB2 的擴(kuò)增［7，8］，EGFR、TGF-beta、VEGF 基因的過(guò)表達(dá)均與胃癌發(fā)生有關(guān)［9，10］。總之，多種因素相互疊加，最終導(dǎo)致胃癌發(fā)生。

表2 胃癌中miR-106a與臨床病理特征的關(guān)系(±s)Table 2 Correlation of of miR-106a expression with clinicopathological factors(±s)

表2 胃癌中miR-106a與臨床病理特征的關(guān)系(±s)Table 2 Correlation of of miR-106a expression with clinicopathological factors(±s)

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微小RNA(microRNA)大部分由基因的內(nèi)含子部位產(chǎn)生，主要通過(guò)抑制mRNA翻譯或促進(jìn)其降解從而調(diào)控基因表達(dá)。目前的研究表明，miRNA分子通過(guò)兩種不同機(jī)制調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。當(dāng)miRNA和編碼蛋白質(zhì)的mRNA幾乎完全配對(duì)時(shí)，miRNA誘導(dǎo)mRNA降解，這種miRNA介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制在植物中比較普遍。當(dāng)miRNA和編碼蛋白質(zhì)的mRNA不完全配對(duì)時(shí)，miRNA通過(guò)不完全的堿基配對(duì)結(jié)合mRNA的3’非編碼區(qū)(3’UTR)，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因翻譯［11］。從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡，參與機(jī)體的發(fā)育、代謝以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等生物學(xué)過(guò)程，其與癌癥發(fā)生的關(guān)系更是癌癥研究新的熱點(diǎn)內(nèi)容。對(duì)胃癌中人類let-7a進(jìn)行定量，結(jié)果顯示胃癌組織中的表達(dá)水平顯著比正常組織低，并通過(guò)與RAB40C基因3’UTR結(jié)合影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性，提示let-7a在胃癌的發(fā)展中起重要作用［12］。

近期的研究表明，miR-106a在結(jié)腸直腸癌［13］、卵巢癌［14］、惡性膠質(zhì)瘤［15］等多種類型的腫瘤組織中高表達(dá)，其表達(dá)調(diào)控的信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。而在星形細(xì)胞瘤中，通過(guò)對(duì)84例瘤體及20例癌旁正常組織中miR-106a表達(dá)量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-106a的低表達(dá)與患者的預(yù)后存在密切的關(guān)系［16］。正是基于以上事實(shí)，本研究利用qRT-PCR方法檢測(cè)了miR-106a在胃癌及其正常組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-106a在胃癌組織相對(duì)于正常組織有明顯的表達(dá)上調(diào)，這種趨勢(shì)與已有的研究報(bào)道一致［17］，同時(shí)這種差異表達(dá)與臨床病理指征有密切相關(guān)性。而最新的研究結(jié)果［18］表明，miR-106a不僅在胃癌組織中存在普遍的上調(diào)，還能通過(guò)FAS介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制miR-106a表達(dá)不僅能阻滯腫瘤細(xì)胞的增殖，還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

本研究中采用real-time PCR檢測(cè)miR-106a在胃癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-106a在胃癌中的表達(dá)較正常組織明顯升高(P＜0.01)。同時(shí)，miR-106a的高表達(dá)與腫瘤分化程度有著密切的相關(guān)性(P＜0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明miR-106a可能參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，受限于樣本數(shù)量較少，未能就miR-106a與胃癌的病理分級(jí)、臨床分期及預(yù)后情況等進(jìn)行深入的分析。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為我們提供了在胃癌分子機(jī)制研究中一個(gè)潛在的靶點(diǎn)，下一步，我們將就miR-106a與其靶基因在胃癌細(xì)胞系中的效應(yīng)進(jìn)行深入分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為進(jìn)一步理解胃癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，尋找對(duì)胃癌診斷、判斷預(yù)后和治療靶標(biāo)有價(jià)值的分子標(biāo)志物奠定良好的基礎(chǔ)。

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