不同時間注射PMSG和HCG對小鼠超排卵效果的影響

陳喜英，郭永昌，劉田福

(山西醫科大學實驗動物中心，太原 030001;*通訊作者，E-mail:13603518575@163.com)

近年來，隨著轉基因技術的迅速發展和成熟，轉基因動物在生物醫藥、生命科學研究領域得到越來越廣泛的應用。國際上報道了多種得到轉基因動物的方法，目前真正成熟并可以穩定得到轉基因動物的方法主要有三種，即原核顯微注射法、精子介導的基因轉移法和核移植。其中，顯微注射法是轉基因最簡單、最常用的的方法，其操作步驟包括受精卵的采集、顯微注射和胚胎移植。要取得原核顯微注射的高成功率首先要得到質量好、數量多的原核期受精卵。小鼠在生理狀態下一次排卵10－15顆，遠不能滿足實驗的需要。為了增加可獲得的卵子數量，用孕馬血清(PMSG)模擬促卵泡激素，用人絨毛膜促性腺激素(HCG)模擬黃體生成素(LH)可以誘發交配雌鼠排卵多于正常排卵數即超排卵。超排反應是一個由一系列極其復雜的生理過程累積而產生的結果，影響因素諸多［1］，包括動物遺傳特性、體況、營養狀態、年齡、發情周期的階段、卵巢的功能狀態、季節、溫度以及激素劑量等。已有多個實驗室對超排反應的條件進行了摸索［2－5］。受精卵的數量和質量主要取決于促性腺激素的注射時間及用量，小鼠品系、鼠齡及體重等。為了進一步探討有效的小鼠超排卵方法，我們在控制其他條件一致的情況下，對給予激素的時間做了實驗分析，以求找到一個最適宜的注射時間，能得到最大數量及最好質量的可用于顯微注射的受精卵。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級昆明系白小鼠雌雄各40只，由山西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(晉2009－0001);雌鼠作為供體鼠，5周齡，體重20－25 g;雄鼠8周齡，體重35 g左右。動物房飼養環境溫度20－24℃，相對濕度50%－55%，光照周期7:30－19:30，正常飼料及飲水。

1.2 主要試劑與器材

M2培養液，M16培養液，透明質酸酶，礦物油均購自美國 Sigma公司，孕母馬血清(PMSG)，人絨毛膜促性腺激素(HCG)均購自寧波激素制藥廠;體視顯微鏡(Motic)、毛細玻璃管(NarisHige)、精細鑷子(Dumont)等各種手術器械。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組、給藥 40只雌性小鼠編號，隨機分為4組，經檢驗組間差異不顯著，4組編號為1，2，3，4。按試驗方案給藥，分別與雄鼠合籠，檢栓。

1.3.2 實驗方案 第1天:11:00，13:00，15:00，17:00分別給1，2，3，4組雌鼠腹腔注射PMSG 5 IU。

第3天:11:00，13:00，15:00，17:00 分別給 1，2，3，4組雌鼠腹腔注射HCG 5 IU，然后立即與雄鼠合籠(雌雄比例為1∶1)。

第4天:于8:00檢查所有雌鼠陰栓，記錄見栓小鼠編號和數目。

1.3.3 獲取受精卵 依組別脫臼處死見栓小鼠，75%酒精體表消毒后開腹;緩慢牽拉子宮暴露輸卵管，剪下輸卵管，將其置于M2液滴中，于鏡下撕破膨大壺腹部，釋放出受精卵。經300μg/ml的透明質酸酶消化后計算每只小鼠受精卵數量。

1.3.4 胚胎體外培養 將洗好的受精卵轉移至平衡好的M16液滴中，置于37℃，5%CO2孵箱中培養過夜，第2天計算每只小鼠獲得二細胞胚胎數。

1.4 統計學分析

2 結果

四組小鼠在不同時間注射PMSG和HCG發生超排反應后獲得的胚胎數，具體結果見表1。

表1 不同激素注射時間對小鼠超排效果的影響(±s)Table 1 Effect of the different administration time of PMSG，HCG on the superovulation in mouse(±s)

表1 不同激素注射時間對小鼠超排效果的影響(±s)Table 1 Effect of the different administration time of PMSG，HCG on the superovulation in mouse(±s)

與其余各組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

2 13∶00 10 9 90* 256 25.60±2.731* 248 24.80±1.737 3 15∶00 10 5 50 138 13.80±1.868 115 11.50±3.277 4 17∶00 10 2 20 66 6.60±1.490 47 4.70±2.736

由表1可以看出，第2組(11:00組)平均獲胚胎數和Ⅱ－細胞胚胎數均為最高，分別為25.6和24.8，而第4組(17:00組)平均獲胚胎數和2－細胞胚胎數均為最低，分別為6.6和4.7。

經F檢驗得，四組間超排效果差異顯著，其中第2組與第1，3，4組間均存在統計學差異(P＜0.01)。

3 討論

小鼠的超排卵是科學研究中得到卵母細胞和胚胎的常規方法。有報道認為5 IU PMSG+5 IU HCG劑量組合對小鼠超排效果最好［6，7］。當PMSG劑量過低時，不能有效促進較多卵母細胞同時發育，也就達不到超排效果;相反，激素劑量過大則會引起卵巢“過刺激”而使卵母細胞的排放率降低，產生抑制作用。

PMSG與HCG間有著相互影響，且也與動物房的明暗周期有關，所以他們的注射時間會影響到排卵的數目及發育的一致性。目前，小鼠超數排卵第一次注射激素采用的時間并不統一［8－10］，超排數量獲卵數一般為20－30枚。小鼠的發情受環境影響，尤其是光照控制，在穩定的光控條件下，排卵一般發生在黑暗后的3－5 h［11］。本試驗所用小鼠在自然光照暗循環為19∶30至7∶30條件下飼養，動物房明暗循環條件能影響外源激素刺激內源激素的釋放［12］。在相同暗循環條件下，激素不同注射時間對小鼠超排有一定影響，HCG應在內源性的LH釋放之前腹腔注射［13］。而內源性LH的釋放是在PMSG的刺激下由明暗周期控制的。我們比較了不同時間注射PMSG及HCG，發現在第1天13∶00注射5 IU的PMSG，48 h后注射5 IU HCG，第4天早上收集卵，獲得的受精卵正常發育成二細胞最多。這樣可以保證HCG至少比內源性的LH早2－3 h進入體內。

以不同起始時間超排小鼠，其排卵、受精及早期胚胎發育時程具有規律性，但本實驗結果表明，在4個不同起始時間超排小鼠所得的排卵數呈現出不同程度的差異。其中原因為，所挑選小鼠的發情周期階段均為發情前期，發情前期持續的時間為17－24 h［2］，部分實驗小鼠處于發情前期早期，部分已經處于發情前期末期，處于發情前期不同階段的小鼠，其卵巢卵泡的發育狀況各不相同，導致了其在超排激素作用后的排卵時間有所差異，從而影響了隨后的受精及胚胎發育時程。其次，小鼠本身存在個體差異，對超排激素刺激的反應和對激素的耐受能力不同，導致促性腺激素對個體作用效果不同，從而出現個體之間排卵、受精和胚胎發育時間不一致，在同一個體也存在排卵時間不整齊、受精時間不一致甚至胚胎發育時程并非同步進行的現象，卵母細胞及早期胚胎的數量也有所差別。在一定程度上也會對小鼠排卵、受精及胚胎發育時程整體的規律性造成影響。但主要原因還是與小鼠自然狀態下發情與交配的生理周期相關。

以13:00為起始時間超排小鼠，其胚胎發育時程趨勢規律性最顯著，這與小鼠自然發情的生理特性相關。在注射 PMSG 48 h后，卵巢卵泡受到PMSG的刺激，大部分已發育成為排卵前卵泡，此時給予HCG注射，可進一步促進卵泡排卵。所以以13:00為起始時間超排，其超排效果較為理想，排卵、受精、胚胎發育規律性最為顯著。

超排是一個極為復雜的過程，影響因素很多，主要有實驗動物的品系、激素劑量、PMSG和HCG注射的間隔時間以及動物的年齡和生殖健康狀態等［14－17］。本文僅就激素注射時間進行探討，說明激素的注射時間對超排有明顯影響。其他因素，如激素的生物活性，動物的某些因素如小鼠的品系，周齡，體重及內分泌活動對超排效果也將產生更直接的影響，今后還有待進一步研究。

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