維甲酸誘導(dǎo)BALB/c近交系小鼠腭裂動物模型的實驗研究

拜薛鵬，南欣榮，閆星泉，劉典偉

(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院口腔頜面外科，太原 030001;*通訊作者，E-mail:xr_nan@sina.com)

先天性腭裂是一種多基因遺傳病，其發(fā)病機(jī)制不清楚，現(xiàn)多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是基因和環(huán)境聯(lián)合作用引起，所以腭裂發(fā)病機(jī)制的研究有助于腭裂的預(yù)防和產(chǎn)前診斷。通過對一些化學(xué)藥物產(chǎn)生腭裂的研究，已能初步指出維生素A族缺乏或過量均可導(dǎo)致腭裂發(fā)生率增高［1，2］，其中 RA 是致畸作用最強(qiáng)的一種。本研究擬通過研究在特定妊娠期給予BALB/c近交系小鼠腭裂模型所需維甲酸(retinoic acid，RA)的最佳劑量，為之后研究致畸分子機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試劑

RA(Sigma公司)于－20℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆?。使用時取出，在避光條件下溶于相應(yīng)容量的玉米油(100 mg RA溶于10 ml玉米油，RA為10 mg/ml)，將其震蕩混勻，立即管飼孕鼠。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠飼養(yǎng) 選取9周齡BALB/c近交系小鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體重20－25 g，飼養(yǎng)在(25±2)℃和人工調(diào)控12 h晝夜循環(huán)條件下，任意給予食物和水。將未交配生育過的雌雄小鼠于第1天下午6:00雌雄3:1合籠交配，第2天上午8:00查看陰栓，有陰栓者定為妊娠(gestation day，GD)0 d，標(biāo)記并稱體重，取出單獨飼養(yǎng)。GD8 d時稱重見陰栓的雌鼠，體重增加小于2.0 g者判定為假孕，取出重新交配，體重增加大于或等于2.0 g者判定為受孕，用于實驗。

1.2.2 分組及給藥 將孕鼠36只，隨機(jī)分為實驗組和對照組，實驗組:共30只，分為5個組，每組6只，其中三組分別在 GD8 d，GD10 d，GD12 d，上午8:00一次性管飼RA玉米油懸液，劑量均為50 mg/kg，其余兩組則于GD10d上午8:00一次性管飼RA玉米油懸液，劑量分別為40 mg/kg和60 mg/kg;另設(shè)對照組:共6只，按給藥時間分為3組，每組各2只小鼠，分別于 GD8 d，GD10 d，GD12 d上午8:00一次性管飼與實驗組等劑量的玉米油。

1.3 胎鼠致畸形及毒性的檢測

記錄胎鼠總數(shù)、腭裂胎鼠數(shù)、每窩胎鼠平均體重。以腭裂比率來評估RA誘導(dǎo)胎鼠腭裂畸形的情況，以胎鼠平均體重評估RA對胎鼠的毒性作用。

1.4 標(biāo)本的制備與染色

GD17 d處死全部孕鼠，剖腹取出胎鼠，觀察胎鼠的畸形情況。計算每個胚胎的體重。在體視顯微鏡下應(yīng)用顯微外科器械剪取腭突。并將部分實驗組和對照組胎鼠的鼠頭脫水、浸蠟、包埋、切片，切片以麥克爾軟骨為基準(zhǔn)面，作冠狀位約5μm連續(xù)切片，HE染色。觀察胎鼠兩側(cè)腭突融合情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對胎鼠體重變化進(jìn)行方差分析。對胚胎腭裂發(fā)生情況進(jìn)行χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎鼠體重變化分析

GD10 d RA處理孕鼠，50 mg/kg RA及60 mg/kg RA實驗組胎鼠均重與對照組(0 mg/kg)胎鼠均重之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)，而40 mg/kg RA實驗組胎鼠均重與對照組胎鼠均重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.181)，50 mg/kg與60 mg/kg RA實驗組胎鼠均重比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);其余各實驗組胎鼠均重之間差異有顯著性(P＜0.05)。50 mg/kg RA對BALB/c近交系小鼠有較強(qiáng)的毒性作用。

GD8d實驗組胎鼠均重與對照組胎鼠均重之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表2)，GD10 d實驗組與對照組胎鼠均重之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而GD12 d實驗組與對照組胎鼠均重之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);50 mg/kg RA處理孕鼠，GD8 d、GD10 d和GD12 d胎鼠均重之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=73.075，P＜0.05，見表2)。GD8 d和GD10d是誘發(fā)BALB/c小鼠畸形的敏感時期。

表1 妊娠10 d胎鼠體重分布(±s)Table 1 The weight of GD10 d embryos after exposed to different doses of RA(±s)

表1 妊娠10 d胎鼠體重分布(±s)Table 1 The weight of GD10 d embryos after exposed to different doses of RA(±s)

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與0mg/kg比較，*P＜0.05;與40mg/kg比較，#P＜0.05

表2 不同給藥時間對各組胎鼠體重的影響(±s)Table 2 The weight of embryo in each group at different feeding time(±s)

表2 不同給藥時間對各組胎鼠體重的影響(±s)Table 2 The weight of embryo in each group at different feeding time(±s)

與0mg/kg比較，*P＜0.05

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2.2 胚鼠腭裂發(fā)生情況

表3結(jié)果顯示:50 mg/kg RA劑量組腭裂發(fā)生率為93.75%，40 mg/kg與60 mg/kg劑量組腭裂發(fā)生率都為0.00%，故認(rèn)定劑量50 mg/kg RA為誘導(dǎo)腭裂畸形發(fā)生最佳用藥劑量(P＜0.05)。其中GD8 d和GD12 d給藥腭裂的發(fā)生率分別為36.00% 和45.83%，而GD10 d給藥腭裂的發(fā)生率最高(P＜0.05)，故認(rèn)定GD10 d為RA誘導(dǎo)BALB/c小鼠腭裂畸形發(fā)生的最佳用藥時間。

表3 不同處理條件下各組胎鼠腭裂發(fā)生情況Table 3 The incidence of cleft palate after exposed to different doses of RA at different time

2.3 胎鼠腭裂的形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 肉眼觀察 肉眼觀察胎鼠腭裂模型，可見胎鼠腭部正中有邊緣不太規(guī)整的裂隙，其長度一般為1.2－2.6cm，最寬處有0.8 cm(見圖1)。

圖1 體視鏡下觀察胎鼠腭裂畸形發(fā)生情況 (×4)Figure 1 Observation of cleft palate under stereoscope (×4)

圖2 HE染色觀察胎鼠兩側(cè)腭突細(xì)胞發(fā)生融合情況 (HE，×40)Figure 2 Morphology of both sides of palatal cells in mice at GD17 d (HE，×40)

2.3.2 光鏡觀察 HE染色顯示:GD17d對照組胎鼠兩側(cè)腭突上抬至舌體完全接觸融合，腭突細(xì)胞相互連接貫通形成完整的腭板;GD17 d腭裂組胎鼠絕大多數(shù)兩側(cè)腭突小但能上抬至正常水平并向水平方向生長，體積較小，不能在中線處相互接觸形成腭融合板(圖2，見第81頁)。

3 討論

先天性腭裂動物模型主要用于腭裂病因?qū)W和發(fā)生機(jī)制方面的研究，目前多用地塞米松、氫化可的松和全反式維甲酸等藥物誘導(dǎo)腭裂動物模型，而全反式維甲酸被認(rèn)為是近年來致畸研究中的一種具有較強(qiáng)的致畸作用的化學(xué)藥物，主要通過結(jié)合維A酸受體調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)來實現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)［3，4］。

在小鼠懷孕不同時間即孕8，10，12 d給予一定劑量的維甲酸均能誘發(fā)腭裂。Kochhar等［5］認(rèn)為GD8 d抑制神經(jīng)嵴細(xì)胞的正常遷移，使腭突缺少足夠的起源細(xì)胞而導(dǎo)致發(fā)育不足，形成腭裂。Harris等［6］認(rèn)為，GD10 d抑制了腭突間充質(zhì)細(xì)胞的增殖，并影響了中嵴上皮的轉(zhuǎn)歸而導(dǎo)致腭裂。而在GD12 d并不抑制腭間充質(zhì)細(xì)胞的增殖，而是干擾了腭的上抬、腭中嵴上皮細(xì)胞的分化以及腭的粘連融合等過程形成腭裂。呂寶輝等［7］以RA為致畸物，誘發(fā)C57BL近交系小鼠腭裂，成功建立了腭裂動物模型，其結(jié)果顯示:GD10 d為最佳致畸時間，100 mg/kg RA為最佳致畸量。Reynolds等［8］對GD10 d的Swiss Webster小鼠一次性管飼50 mg/kg RA誘導(dǎo)出100%腭裂小鼠模型。然而，我們所做預(yù)實驗得出:當(dāng)RA劑量為100 mg/kg對BALB/c近交系小鼠是致死劑量，最終確定50 mg/kg RA對BALB/c近交系小鼠有較高的致畸率。

本實驗中，在BALB/c近交系小鼠GD10 d管飼50 mg/kg RA誘導(dǎo)胎鼠腭裂畸形在93%以上。大體畸形除腭裂外，主要畸形為短前肢，偶見有短尾發(fā)生。因此，GD10 d，一次性管飼 RA 50 mg/kg，是BALB/c近交系小鼠腭裂形成的理想動物模型。

綜上所述，本次實驗建模基本成功，成功誘導(dǎo)了胎鼠腭裂，為后續(xù)腭裂形成原因及分子機(jī)制的研究提供理想動物模型。

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