miR-145抑制口腔鱗狀細胞癌Tca-8113細胞增殖活性及其與CDK6的靶向關系

郭 芳，黃 碩

(西安醫學院口腔醫學系，西安 710021;*通訊作者，E-mail:guofang198419@163.com)

miRNA是一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約20－25個核苷酸。其不但可以直接發揮原癌基因或者抑癌基因的作用，而且可以通過降解靶mRNA或者抑制靶信使RNA(mRNA)的翻譯調節其他癌基因或者抑癌基因的表達［1，2］。據報道，miRNA 在人類的各種生物過程均發揮重要作用，如新陳代謝、分化、細胞增殖和凋亡［3］。microRNA已被證實與癌癥的發生和發展是密切相關的，其可能成為癌癥診斷的新的生物學標記物［4］。

研究表明，miR-145 在調節干細胞分化［5，6］、多種惡性腫瘤(如結腸癌［7］、前列腺癌［8］、乳腺癌［9］、宮頸癌［10］等)的發生過程中發揮著重要作用。有關miR-145在口腔鱗狀細胞癌中的研究報道尚少。本研究通過生物信息學預測miR-145的靶基因，構建pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145重組表達質粒，通過雙熒光素酶報告基因預測miR-145對下游靶基因CDK6表達的影響，以及對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNATM6.2-GW、pmirGLO真核載體、口腔鱗狀細胞癌Tca-8113細胞株、E.coli DH5α均由西安交通大學醫學部實驗中心提供。

T4DNA連接酶、限制性內切酶(Hin dⅢ、Eco RⅠ、SacⅠ和 XhoⅠ)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和逆轉錄試劑盒(PrimeScript3?RT)均購自Takara公司(大連)，質粒抽提、凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司，RNA抽提試劑Trizol轉染試劑Lipofectamine2000購自美國vitrogen公司，RIPA、SDSPAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術公司，PVDF膜、蛋白發光液購自Millipore公司，鼠抗人βactin購自Santa Cruz公司，兔抗人CDK6購自北京博奧森生物技術有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司，其余試劑均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 miR-145表達載體的構建與鑒定 從miRBase網站數據庫中檢索has-miR-145的pre-miR-145頸環序列，設計合成兩端帶有Hin dⅢ和Eco RⅠ酶切位點的互補雙鏈DNA，序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，一條為 AAT TCCACCTTGTCCTCACGGTCCAGTTTTCCCAGGAATC CCTTAGATGCTAAGATGGGGATTCCTGGAAATACTG TTCTTGAGGTCATGGTTA，另一條為AGCTTAACCAT GACCTCAAGAACAGTATTTCCAGGAATCCCCATCTT AGCATCTAAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACCGTGA GGACAAGGTGG。Hin dⅢ和Eco RⅠ雙酶切質粒載體pcDNATM6.2-GW，用T4DNA連接酶連接線性化質粒載體與目的基因退火片段，轉化感受態細菌E.coli DH5α，挑取單個克隆后采用含壯觀霉素的LB培養基篩選擴增，12-16 h后提取質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司對重組質粒pcDNATM6.2-GW-premiR-145進行測序鑒定。

1.2.2 實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)驗證 miR-145在Tca-8113細胞中的表達 將構建成功的重組質粒 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145轉染 Tca-8113細胞，然后采用qRT-PCR檢測成熟miR-145的表達水平。實驗分組:miR-145組為轉染重組質粒pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145;control組為未作處理的Tca-8113細胞;miR－145的逆轉錄引物序列GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTG GATACGACAGGGATT，上游引物為:5’－CAGTGCGTGTCGTGGAGT－3’，下游引物為:5’－AGGTCCAGTTTTCCCAGG－3’，U6作為內參。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ進行擴增，條件:95℃，1 min預變性，95℃變性10 s，60℃退火，延伸40 s，重復40個循環，采用2－ΔΔCt計算miR-145表達量。

1.2.3 MTT檢測miR-145對Tca-8113細胞增殖的影響 Tca-8113細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養基，放置于37℃，5%CO2的恒溫細胞培養箱中進行培養。96孔板每孔約3 000個細胞，采用Lipofectamine2000脂質體轉染試劑按說明書進行轉染。實驗分組:miR-145組為轉染pcDNATM 6.2-GW-pre-miR-145重組質粒;Neg-miR-145組為轉染pcDNATM6.2-GW空質粒;各組設3個復孔，于轉染后24 h、48 h、72 h后加入20μl，37℃孵育4 h后棄上清，加入150μl后于492 nm波長下檢測Tca-8113細胞的吸光度值。

1.2.4 熒光素酶報告基因載體的構建與鑒定 采用targetscan(http://www.targetscan.org/)根據堿基互補配對原則選取miR-145的候選靶基因CDK6，分別于CCAATAATCCTTTGGAAACTGGATC及其互補鏈TCGAGATCCAGTTTCCAAAGGATTATTGGAGCT兩側添加SacⅠ和XhoⅠ雙酶切位點，命名為野生型CDK6(WT-CDK6)，同時在種子區設計突變型CDK6(MT-CDK6)，堿基序列由公司加工合成，并采用Annealing Buffer退火為雙鏈，并連接于pmirGLO真核表達載體上，轉化與測序方法和miR-145相一致。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-145對CDK6的靶向作用 收集對數期的Tca-8113細胞，鋪于96孔板，每孔約4×103個細胞，設4組、每組設3個復孔，24 h后分別轉染Neg-miR(pcDNATM6.2-GW空質粒)+WT-CDK6，Neg-miR+MT-CDK6，miR-145+WT-CDK6，miR-145+MT-CDK6。24h后，根據Promega公司雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書添加螢火蟲和海腎熒光素酶試劑上機檢測。

1.2.6 Western blot檢測 miR-145 對 CDK6 蛋白表達的調控 實驗分組同MTT，轉染24 h后胰酶消化細胞后采用PBS洗2遍后收集Tca-8113細胞，采用RIPA裂解液按照操作說明提取蛋白，配置10%的SDS-PAGE凝膠，每孔20μg蛋白量上樣、電泳，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗(CDK6 1∶100;β-actin 1∶3 000)4 ℃孵育過夜，二抗室溫下孵育1.5 h，TBST洗膜，化學發光觀察蛋白的表達情況。

1.2.7 統計學分析 采用SPSS12.0軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗進行分析，P＜0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建miR-145表達載體

Hin dⅢ和Eco RⅠ雙酶切質粒載體pcDNATM6.2-GW與退火成雙鏈的pre-miR-145相連接后，將重組的miR-145真核表達載體進行測序，結果表明重組的pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145真核表達載體無堿基序列的突變與丟失。采用qRT-PCR檢測miR-145在miR-145組與control組中的表達，結果顯示miR-145組中miR-145的表達顯著高于內源性表達量(P＜0.001，見圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測miR-145在miR-145組與control組中的表達Figure 1 The expression of miR-145 in miR－145 group and control group using qRT-PCR

2.2 miR-145能夠抑制Tca-8113細胞的增殖

將 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145 和 pcDNATM 6.2-GW空載體分別轉染口腔鱗狀細胞癌Tca-8113細胞;如圖2所示，轉染miR-145的 Tca-8113細胞的增殖活性明顯低于空載體組(P＜0.01)，表明miR-145能夠明顯抑制口腔鱗狀細胞癌Tca-8113細胞的增殖。

2.3 miR-145能夠靶向下調CDK6的表達

通過Targetscan預測miR-145與CDK6間存在良好的堿基互補配對，在此基礎上成功構建CDK6野生型(WT-CDK6)及突變型(MT-CDK6)真核表達載體(圖3)，與miR-145和Neg-miR共轉染Tca-8113細胞。雙熒光素酶報告基因檢測顯示共同轉染miR-145+WT-CDK6后，熒光素酶活性表達明顯受到抑制，而轉染 Neg-miR+WT-CDK6，Neg-miR+MT-CDK6，miR-145+MT-CDK6組的熒光素酶活性無明顯變化。結果表明，miR-145與CDK6之間存在良好的靶向關系(P=0.002，見圖4)。

圖2 MTT法檢測Neg-miR組與miR-145組的細胞增殖情況Figure 2 Cell proliferation in Neg-miR group and miR-145 group by MTT

圖3 Targetscan預測miR-145與CDK6堿基互補情況及突變位點Figure 3 Predicted miR-145 and CDK6 complementary base and mutations in Targetscan

圖4 雙熒光素酶報告基因分析結果Figure 4 Dual-Luciferase reporter assay results

2.4 miR-145能夠抑制內源性CDK6蛋白的表達

Western blot檢測結果顯示，轉染 pcDNATM 6.2-GW-pre-miR-145的Tca-8113細胞其下游CDK6的蛋白表達水平顯著低于轉染pcDNATM 6.2-GW空載體的 Tca-8113細胞，表明miR-145能夠抑制Tca-8113細胞中CDK6的蛋白表達水平(見圖5)。

圖5 Western blot檢測miR-145對CDK6蛋白表達的調控Figure 5 The regulation of miR-145 to CDK6 protein expression by Western blot

3 討論

2003年世界口腔健康統計數據顯示口腔鱗狀細胞癌占口腔惡性腫瘤的90%以上，口腔鱗狀細胞癌的發病率在26種主要惡性癌癥中位居第八位，盡管隨著手術技術和基礎研究的進步，包括手術為主，放療和化療在內的綜合治療，使其5年死亡率已經明顯下降，但是仍然是癌癥死亡的主要疾病之一。因此，尋找新的生物標志物和探索新的治療靶點，對口腔鱗狀細胞癌的診斷和治療具有重要意義。

近年來，microRNA是一個研究熱點，其廣泛存在于生物體內，是一類長度在19-25 bp、高度保守的非編碼小RNA，是具有莖環狀結構的單鏈RNA分子。miRNA以序列特異性的方式調節基因表達，在動植物發育、細胞凋亡、代謝以及疾病發生等方面都起著重要作用，從而受到廣泛關注。生物信息學研究發現microRNA只有人類基因總數的2%，卻調節著人類全基因組中30%以上的基因表達［11］，因此，其可以成為一個比較穩定的抗癌靶點。

Kozaki等［12］檢測了 148 個 miRNAs在 18 個口腔鱗狀細胞癌細胞系中的表達，結果發現其中有54個miRNAs表達下調，11個miRNAs表達上調。原癌基因miRNAs常在腫瘤組織中的表達上調，促進腫瘤的發生和發展;相反，抑癌基因miRNAs常表達下調，減少或消除對腫瘤發展的抑制作用。miR-145定位于染色體5q32-33，被發現在多種腫瘤中低表達，如直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、胰腺癌、尤文氏肉瘤等，且通過作用于多個靶基因來抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，發揮類似于抑癌基因的作用。如Chiyomaru等［13］研究發現在膀胱癌中miR-145可以作為抑癌基因下調FSCN1的mRNA和蛋白表達。Wang等［14］發現在乳腺癌MCF-7細胞中過表達的miR-145可以抑制RTKN蛋白表達以及其mRNA水平，并且miR-145過表達質粒可以抑制MCF-7細胞生長并誘導其凋亡。miR-145能抑制前列腺癌PC-3細胞的增殖，促進其凋亡，促使細胞周期阻滯并抑制其侵襲轉移，起到抑癌基因的作用。但是miR-145在口腔鱗狀細胞癌中的相關研究目前報道較少。

為了研究miR-145在口腔鱗狀細胞癌發生發展的作用機制，本研究通過構建miR-145真核表達載體，將構建成功的表達載體轉染Tca-8113細胞系，并采用熒光實時定量PCR檢測miR-145的含量，結果顯示miR-145組中miR-145的表達顯著高于未作處理的Tca-8113組。為了進一步研究miR-145的過表達對Tca-8113細胞增殖活性的影響，我們采用MTT法進行了檢測，將 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145和pcDNATM6.2-GW空載體分別轉染口腔鱗狀細胞癌 Tca-8113，結果發現轉染 miR-145的 Tca-8113細胞的增殖活性明顯低于空載體組(P＜0.01)，表明miR-145能夠抑制口腔鱗狀細胞癌Tca-8113細胞的增殖。

我們對miR-145抑制Tca-8113細胞增殖的機制進行了初步探討，生物信息學軟件是預測miRNAs靶基因的重要方法之一。目前被證實的miRNA靶基因均是以生物信息學的預測為基礎的。首先，通過生物信息學的方法預測miR-145可能作用的靶基因，結果發現，CDK6可能是miR－145的候選靶基因。為了對其進行驗證，本研究采用雙熒光素酶報告基因系統進行驗證，結果表明共同轉染miR-145和WT-CDK6后，熒光素酶活性表達明顯受到抑制，說明miR-145能夠對Tca-8113細胞中的CDK6基因起到抑制性的調控作用。Western blot結果表明miR-145能夠抑制Tca-8113細胞中CDK6的蛋白表達水平，進一步驗證了二者之間的靶向關系。

綜上所述，在口腔鱗狀細胞癌中，miR-145的過表達可以顯著抑制Tca-8113細胞的增殖活性，同時可以靶向CDK6引起其蛋白表達水平的下調，而CDK6作為一個周期蛋白，又與細胞的增殖密切相關，因此，本研究初步推測miR-145可能通過靶向CDK6引起口腔鱗狀細胞癌Tca-8113細胞的增殖活性，這也為我們后期進一步的機制研究奠定了一定的理論基礎。

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