COX-2抑制劑對人舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞COX-2和Ang-1基因表達的影響

王曉彥，武云霞

(1深圳市龍崗中心醫院耳鼻咽喉分院口腔科，深圳 518172;2山西醫科大學第一臨床醫學院口腔科)

血管形成在腫瘤的發生發展中起著重要的作用，實體瘤的生長需要血管提供氧氣和營養，沒有血管生成，原發腫瘤不會超過1－2 mm3［1］。近年來研究表明COX-2與多種腫瘤的部位及病理學分級無關，而與腫瘤的浸潤、淋巴結轉移和預后不良有關，提示COX-2在腫瘤的發生、發展和轉移中有重要的生理功能［2］，并參與實體腫瘤的血管生成［3，4］，但其機制尚不完全明確。本試驗通過研究COX-2抑制劑尼美舒利 NIM(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)對人舌鱗癌Tca-8113細胞中COX-2、Ang-1基因表達的影響以探討其抗血管生成的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人舌鱗狀細胞癌細胞株Tca－8113購自中科院上海細胞生物研究所，培養于含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養液的培養瓶中，0.25%的胰蛋白酶消化傳代，RNA抽提試劑盒W6221(上海華舜生物工程有限公司)，隨機引物、RNase抑制劑、dNTP AMV逆轉錄酶和TaqDNA酶(均為 Fermentas公司)，COX-2、Ang-1和 GAPDH引物(上海生工生物工程公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 分組 Tca-8113對數生長期細胞數量至1×106/ml接種于培養瓶中，24 h后換液。NIM處理組濃度為25，50，100 和200 μmol/L;對照組含0.4%的等量二甲基亞砜。培養48 h后收集細胞，各組均重復3瓶。

1.2.2 RT-PCR檢測Ang-1基因的表達 按 RNA抽提試劑盒W6221說明書提取細胞總RNA，測定RNA純度并定量。cDNA過程為:總RNA 2μl、隨機引物1μl，DEPC水補至終體積12μl，混勻，離心3－5 s，70 ℃變性 5 min，冰上冷卻 3－5 min，離心3－5 s，冰上冷卻3－5 min，依次加入5倍緩沖液4 μl、RNase抑制劑 1 μl、10 mmol/L dNTP 混合液 2 μl，混勻，25℃溫浴5 min，加入 AMV逆轉錄酶1 μl，25 ℃10 min，42 ℃60 min，72 ℃10 min終止反應后置于冰上。

PCR擴增體系為10倍緩沖液2.5μl、25 mmol/L MgCl24μl、10mmol/L dNTP 混合液1μl、50μmol/L上下游引物(引物序列見表1)各0.5μl、cDNA模板10μl、TaqDNA 酶2μl、雙蒸水補終體積至 50 ml。10μl的PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠顯色，目的條帶用圖像分析系統作光密度測定，以COX-2、Ang-1光密度值分別與GAPDH光密度值之比值作為其mRNA相對含量。

表1 不同基因引物序列及大小Table 1 Gene primer sequences

1.3 統計學分析

2 結果

NIM各處理組與對照組之間COX-2、Ang-1 mRNA表達進行比較，差異有統計學意義(P＜0.01，見表2)。Tca-8113細胞經過后可在Tca-8113細胞中檢測到COX-2和Ang-1 mRNA表達顯著下降(見圖1)。Pearson相關性顯示，COX-2 mRNA表達與NIM濃度之間有相關性(r=－0.963，P＜0.01)，Ang-1mRNA表達與NIM濃度之間也呈負相關(r=－0.988，P＜0.01)，表明 NIM 的抑制作用在一定濃度范圍內呈濃度依賴性。

表2 Tca-8113細胞中COX-2 mRNA和Ang-1 mRNA表達定量分析(±s，n=3)Table 2 Quantity analysis of expression of COX-2 mRNA and Ang-1 mRNA in Tca-8113 cells(±s，n=3)

表2 Tca-8113細胞中COX-2 mRNA和Ang-1 mRNA表達定量分析(±s，n=3)Table 2 Quantity analysis of expression of COX-2 mRNA and Ang-1 mRNA in Tca-8113 cells(±s，n=3)

與對照組比較，a F=151.778，a P＜0.01;與對照組比較，b F=232.384，b P＜0.01

NIM 50 μmol/L 0.577 9±0.026 5a 0.503 8±0.027 1b NIM 100 μmol/L 0.500 8±0.011 5a 0.322 4±0.018 0b NIM 200 μmol/L 0.290 8±0.021 4a 0.196 6±0.002 5b

圖1 Tca-8113細胞GAPDH、COX-2、Ang-1 mRNA表達的RT-PCR結果Figure 1 RT-PCR analysis results of GAPDH，COX-2 mRMA and Ang-1 mRNA

3 討論

自從1954年Algire提出腫瘤血管形成概念以來，人們就逐漸認識到腫瘤是由腫瘤細胞和血管兩部分有機地組成。腫瘤條件下的血管生成是一持續、無控性的過程［5］。血管形成在腫瘤的發生發展中起著重要的作用，腫瘤的血管生成是由促進和抑制血管生成因子之間的不平衡造成的，在這些促進血管生成的因子之中，目前研究得最多的就是血管生成素(angiogenins，Angs)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。

血管生成素共有4名家族成員，分別為Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4，其中對 Ang-1和 Ang-2的研究比較多。Ang-1基因位于染色體8q22，是Tie-2的激活劑，主要由血管旁細胞包括周細胞、血管平滑肌細胞和腫瘤細胞表達。Ang-1表達及其作用要晚于Ang-2及VEGF，Ang-1具有吸引血管周細胞和內皮平滑肌細胞聚集并相互作用，增強血管內皮細胞間連接從而有利于維持血管壁完整，促進血管重塑、穩定血管、防止滲漏的作用［6］。Wurmbach 等［7］用免疫組化檢測Ang-1/Tie-2在前列腺癌中的表達，發現Tie-2表達于腫瘤性血管內皮細胞，Ang-1表達于腺樣腫瘤細胞，瘤組織周圍大量血管生成，推測Ang-1/Tie-2以旁分泌的方式誘導癌組織的血管生成。有研究表明腫瘤中存在自分泌機制，即由腫瘤細胞分泌的Ang-1在以旁分泌方式促進腫瘤血管生成的同時，還可能以自分泌方式作用于腫瘤細胞，對腫瘤細胞的增殖和凋亡產生影響［8］。Park等［9］通過對早期肺癌切除的患者研究認為，Ang-1血清水平可作為術后預后指標。其促進腫瘤血管生成的機制可能有以下幾個方面:①抑制內皮細胞凋亡;②介導血管內皮細胞與血管旁細胞間的相互作用;③抑制腫瘤細胞凋亡。

COX-2表達是口腔腫瘤發生的早期事件，提示其可能在口腔腫瘤的發生發展中起作用［10］。研究發現，COX-2抑制劑能降低結腸癌的發病率，其機制主要是誘導細胞凋亡、調控細胞周期、影響腫瘤新生血管生成等［11］。Fu 等［12］通過反義 COX-2 mRNA轉染胃癌細胞株發現抑制COX-2的表達能部分逆轉癌細胞增殖和遷移，治療胃癌過程中發現COX-2抑制劑在抑制腫瘤新生血管生成中起著重要作用。

在本研究中，人舌鱗癌Tca-8113細胞經過不同濃度COX-2抑制劑NIM處理后，COX-2和Ang-1基因在細胞中表達明顯下降，且表達下降程度呈濃度依賴性，兩者下降呈正相關。這提示NIM可以抑制COX-2的活性，藥物濃度加大抑制程度增加，同時Ang-1基因表達也隨著藥物濃度增加被抑制程度增加。說明NIM是通過COX-2途徑下調Ang-1基因表達，推斷通過COX-2抑制劑阻斷COX-2表達可使得Ang-1基因表達降低，從而阻斷腫瘤血管的生成。

近年來，COX-2已成為一些腫瘤防治的新靶點。NIM可通過抑制COX-2來抑制腫瘤生成，因而其不僅可用于腫瘤的化學預防，還很有可能用于臨床治療。未來需要進一步確定NIM用于人類口腔腫瘤化學預防和治療的劑量、時間及適宜的人群，為預防頭頸部腫瘤發生及抗腫瘤治療提供切實可行的方案;其次，積極開發新的選擇性COX-2抑制劑，有望成為腫瘤的臨床治療的輔助手段之一。

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