甘丙肽過表達轉基因小鼠的制作和鑒定

陳喜英，劉田福，郭永昌

(山西醫科大學實驗動物中心，太原 030001;*通訊作者，E-mail:13603528575@163.com)

甘丙肽(galanin，GAL)是由29個氨基酸組成的羧基末端酰胺化的肽類物質，由Tatemoto等于1983年首次從豬小腸中檢測出來，廣泛分布在外周和中樞神經系統中［1］。研究發現，它具有抑制葡萄糖介導的胰島素釋放，抑制脂肪組織中抵抗素基因的表達，促進食欲，抑制胃腸蠕動，提高垂體生長激素、促黃體生成激素、催乳素釋放等功能，參與攝食、學習記憶、痛覺和神經性損傷、修復與退行性變等一系列生物活動［2－6］。

在正常的生理情況下，甘丙肽的表達量很低，而且大腦不同區域的甘丙肽與不同神經遞質組成復雜的功能系統［7－9］，但是由于研究技術受到限制，使得甘丙肽的生理病理功能的研究工作進展緩慢。到目前為止，甘丙肽的具體功能和作用機制仍不十分清楚，因此，有待于新的甘丙肽研究工具推進甘丙肽的研究步伐。本文以顯微注射的方法建立了甘丙肽過表達轉基因小鼠模型，為進一步研究GAL在神經系統的生物學功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠，4－6周齡，40只;由山西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(晉2009－0001)。明周期7:30－19:30，暗周期19:30－7:30，溫度19－22℃。相對濕度:40%。自由進食進水。

1.2 主要試劑和儀器

質粒PUC18－PDGFβ－GAL(本實驗室前期制備)，質粒提取試劑盒(Qiagen公司);膠回收試劑盒(Qiagen公司);M2培養基，M16培養基，透明質酸酶，礦物油(Sigma公司);孕馬血清(PMSG)，人絨毛膜促性腺激素(HCG)(寧波激素制藥廠);Taq酶、內切酶和鼠尾提取DNA試劑盒等(大連TAKARA公司);體視顯微鏡(Motic)、顯微注射儀，毛細玻璃管、精細鑷子(Dumont)等各種手術器械。

1.3 實驗方法

1.3.1 轉基因片段的制備 質粒提取(按質粒提取試劑盒進行)，將所提取的質粒用XbaⅠ和Hin dⅢ進行雙酶切，37℃水浴4 h，后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定。對目的條帶進行膠回收(按QIA quick Gel Extraction Kit進行)，把膠回收的DNA溶液移入針頭式濾器中進行純化，用TE緩沖液稀釋成3 ng/μl備用。

1.3.2 轉基因小鼠的制備

1.3.2.1 取胚 以4－6周齡性成熟雌鼠為胚胎供體，腹腔注射PMSG和HCG進行超數排卵，每只5 IU，后與種雄鼠合籠。次日，處死見栓小鼠，在解剖顯微鏡下將胚胎細胞撿出，置于覆蓋有石蠟油的M16微滴中，于5%CO2，37℃培養箱暫時培養。

1.3.2.2 受精卵顯微注射 顯微注射于取胚當日13:00左右開始，把胚胎取出置于M2液滴中。將DNA溶液注射至雄性原核中，見到原核稍稍膨大即取針進行下一枚卵的注射。注射后的胚胎重新移回新的M2液滴中，準備移植。

1.3.2.3 胚胎移植 將形態良好的胚胎吸入移卵針細長端，盡量將胚胎排列緊密以減少培養液的吸入量。采用輸卵管端口插入移植法，將含有胚胎的M2段吹入輸卵管。做完手術后，把它放入溫暖的環境中，蘇醒后5 h禁飲食，之后加精飼料喂養，待產。

1.3.3 轉基因小鼠的鑒定

1.3.3.1 PCR鑒定轉基因小鼠 仔鼠出生后2周剪取約1 cm長鼠尾，按鼠尾提取DNA試劑盒抽提基因組。以此基因組為模板進行 PCR反應。在25 μl反應體系中分別加入:ddH2O 8.6 μl，引物1 上游引物0.8 μl，下游引物 0.8 μl，引物 2 上游引物0.4 μl，下游引物 0.4 μl，Premix Taq 12.5 μl，DNA 1.5 μl。

所用引物序列為:引物 1上游引物:5’－CCCACCTCTCGCACTCTCC－3’，下游引物:5’－TTCTCCTTTGCAGGCATCCCA－3’;引物2上游引物:5’－TCTTAGCTCTGCTCTCCGGT－3’，下游引物:5’－CACTGGCTGAGGAAGGAGAC－3’。轉基因產物長度 397 bp，體內自身 GAL產物長度196 bp。反應條件:94℃ 3 min;94℃ 30 s，60℃ 35 s，72℃ 35 s，38個循環;72 ℃ 5 min。取5 μl PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統分析結果。

1.3.3.2 Western－blot檢測轉基因小鼠GAL表達通過組織勻漿分別提取甘丙肽首建鼠PCR鑒定陽性轉基因小鼠和同窩陰性對照小鼠的肝、腦組織蛋白，蛋白定量后，取100μg進行10%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠(SDS－PAGE)電泳分離蛋白，將蛋白條帶電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶封閉液中室溫封閉1 h。加入新鮮一抗液(GAL一抗和GAPDH一抗稀釋度均為1∶500)，4℃孵育過夜，回收一抗，PBST液洗膜3次，每次5 min。加入新鮮配制的二抗液(GAL二抗稀釋度為1∶3 000;GAPDH二抗稀釋度為1∶5 000)，室溫孵育1 h，棄二抗，PBST液洗膜3次，每次5 min，經熒光化學發光成像儀曝光、顯影。

2 結果

2.1 質粒PUC18－PDGFβ－GAL的雙酶切鑒定

質粒經XbaⅠ和Hin dⅢ進行雙酶切后，骨架大小約為2 700 bp，目的片段 PDGF－GAL大小在3 000 bp左右(圖1)。測序結果與理論上的重組片段進行比對，相似性達到99%，并且在編碼區沒有出現堿基的突變。

圖1 重組質粒PDGFβ-GAL的雙酶切電泳圖Figure 1 Electrophoresis of enzyme digestion of recombinant plasmid PDGFβ-GAL

2.2 轉基因小鼠的整合鑒定

小鼠出生14 d提取基因組DNA，用PCR擴增GAL目的基因397 bp的片段來鑒定GAL轉基因小鼠基因表型(見圖2)，共得到8只首建鼠，5只雄鼠和3只雌鼠，其中7只已傳代。

圖2 GAL過表達轉基因小鼠PCR鑒定圖Figure 2 Identification of galanin-overexpression transgenic mice by PCR

2.3 GAL轉基因小鼠的表達分析

為了驗證外源性GAL在小鼠體內的蛋白表達水平，我們取4只PCR鑒定陽性的小鼠斷髓處死后解剖，同時取1只陰性小鼠作對照分別取肝、腦組織，勻漿處理后部分Western blot檢測GAL蛋白表達水平。F0代陽性小鼠GAL在腦組織中表達水平明顯高于同窩陰性小鼠，而在肝組織中無明顯差異(見圖3)。

圖3 Western blot檢測腦、肝組織中GAL蛋白的表達Figure 3 Expression of GAL protein in brain and liver tissues by Western blot

3 討論

轉基因動物技術是功能基因組時代醫學生物學研究不可或缺的遺傳工程技術。自20世紀80年代初Palmiter等［10］開創了轉基因動物研究的先河以來，轉基因動物技術取得了很大進展。在現行的轉基因動物制備技術中，顯微注射法最經典、應用最廣泛，并在多個物種均有成功報道的轉基因動物制備技術。

甘丙肽是近年來倍受研究者關注的一個基因，其功能是通過GAL受體GALR1、GALR2和GALR3中的一個或多個介導的，由此研究者從甘丙肽與其不同受體的相互作用著手，深入研究其與各種疾病的聯系。早期研究表明GAL參與促進神經系統神經元的生長，發育和再生，隨著免疫組化、原位雜交技術的廣泛應用，發現神經損傷、缺血、老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)、抑郁癥(depression)等病人GAL及其受體的表達都明顯上調［11，12］。這些結果提示了GAL極有可能參與了神經損傷反應，神經再生或修復等事件［13，14］。甘丙肽作為腦內重要的神經肽之一，已被證明不但參與許多神經系統性疾病如癲癇等的重要功能活動，還具有抗腫瘤作用［15，16］，在不同組織中甘丙肽的作用主要取決于其與GALR1－3中不同受體的作用，如在人垂體腺瘤中可同時檢測到甘丙肽及其受體GALR1和GALR2基因的mRNA，但是GALR3 mRNA僅出現在接受手術治療后又復發的病人的垂體腺瘤組織中，這項研究成果為垂體腺瘤病人的預后提供了重要依據［17］，有研究者明確提出甘丙肽受體對傷害性直覺，癲癇等生理病理方面有重要調節作用［18，19］，說明不僅甘丙肽蛋白，其甘丙肽受體在不同疾病發生發展中也起著舉足輕重的作用。總而言之，甘丙肽及其相關蛋白在機體生理或病理狀態下的作用是廣泛而復雜的，至今仍成為國內外學者的研究熱點。

但由于機體自身甘丙肽的表達量少，使得研究工作一直進展緩慢。基于之前的研究報道，我們以GAL為靶基因，成功構建了PDGFβ-GAL目的片段，通過顯微注射技術成功建立了8只GAL過表達的的轉基因小鼠，操作過程簡單，無需特殊設備，而且注射卵的成活率高，很大程度上提高了轉基因的效率。PCR技術能夠方便、快捷的檢測出轉基因事件的發生，被廣泛用于轉基因動物的檢測，但是當目的基因拷貝數較低時容易出現假陽性［20］，而Southern雜交的方法對于轉基因小鼠的PCR整合檢測可以起到互補作用。構建轉基因動物的關鍵在于外源性蛋白的表達以及產生的蛋白是否具有生物學活性，因此我們進一步通過Western blot的方法進行了外源性GAL蛋白表達的檢測，研究結果顯示轉基因陽性小鼠較同窩陰性對照高表達外源性GAL。綜上所述，通過顯微注射的方法構建了GAL轉基因小鼠，并能穩定傳代，即GAL過表達轉基因小鼠在轉錄和蛋白表達水平構建成功。

我們取PCR鑒定陽性F0及同窩陰性對照的腦、肝組織分別提取組織蛋白，進行Western blot檢測，獲得了腦組織特異性高表達的GAL轉基因小鼠。這是因為甘丙肽主要分布在神經系統中，而我們構建目的片段時使用的啟動子PDGFβ鏈是在神經組織特異性表達的［21，22］，包括神經元、樹突、部分軸突、腦的終端神經和脊索的背根和靈長類的垂體后葉［23］，而且PDGFβ鏈啟動子參與調控其下游基因在神經組織特異表達［24，25］。因此我們所制備的轉基因小鼠同人類的表達情況是相吻合的，這可以對以后GAL參與的疾病的治療預后研究中提供動物模型。

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