蠅蕈醇激動(dòng)GABAC受體對(duì)青霉素致大鼠癲癇的影響

范彥英，廖玉芳，肖 奕，張艷欣，王明正

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，太原 030001;*通訊作者，E-mail:wang5695695@163.com)

癲癇是一組以大腦神經(jīng)元同步異常興奮放電引起發(fā)作性、短暫性與刻板性腦功能異常的綜合征，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)最常見的慢性腦部疾病之一。目前我國(guó)癲癇患者人數(shù)已經(jīng)超過1 000萬，且每年新發(fā)癲癇病人在40萬左右。由于癲癇的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，給癲癇的防治工作進(jìn)展帶來一定困難。

根據(jù)癲癇發(fā)作具有突發(fā)性，且能夠自行緩解或自行終止發(fā)作這一規(guī)律可以認(rèn)為，人類腦內(nèi)存在“內(nèi)源性抗癲癇系統(tǒng)”［1］。大量的研究表明，γ－氨基丁酸(γ－aminobutyric acid，GABA)是具有抗癲癇作用的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，其可作用于氯離子通道型的GABAA和 GABAC受體及代謝型的 GABAB受體［2，3］。已有的研究證實(shí)，在癲癇發(fā)作和自行終止過程中，GABAA和GABAB受體發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。如DeLorey等［4］發(fā)現(xiàn)GABAA受體β3亞基缺失的小鼠可出現(xiàn)異常腦電和癲癇發(fā)作，而人類家族性癲癇的發(fā)作也與GABAA受體亞基的變異有關(guān)［5］。另有研究表明，GABAB受體缺失的小鼠，可自發(fā)形成類似失神性癲癇患者的棘波，棘慢波［6］，GABAB受體的表達(dá)或功能的異常可能促進(jìn)大鼠原發(fā)性癲癇的形成［7］。GABAC受體雖與GABAA受體同屬配體門控型氯離子通道，但與GABAA受體相比，GABAC受體對(duì)GABA具有更高的敏感性，也擁有更持久的開放時(shí)間，介導(dǎo)的內(nèi)向氯離子電流緩慢而持久［8］。此外，其對(duì)GABAA受體的調(diào)節(jié)劑如巴比妥類，苯二氮類，GABAA受體的典型阻斷劑荷包牡丹堿(bicuculline)以及GBABB受體激動(dòng)劑巴氯芬等不敏感［9］。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，在電刺激大鼠坐骨神經(jīng)和青霉素(penicillin)協(xié)同誘發(fā)癇性放電模型中，GABAC受體的 ρ2亞基 mRNA 表達(dá)減少［10］，但GABAC受體對(duì)于癲癇發(fā)作和終止的影響尚不明確。

為此，本實(shí)驗(yàn)采用青霉素誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作模型，以GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿、GABAB受體阻斷劑高牛磺酸(homotaurine)和GABAC受體激動(dòng)劑蠅蕈醇(muscimol)為工具藥，探討GABAC受體在內(nèi)源性抗癲癇機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康清潔級(jí)SD大鼠共144只，體重180－220 g，均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均遵照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度控制的環(huán)境(22－25℃)下，12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。荷包牡丹堿、高牛磺酸和蠅蕈醇均購(gòu)于Sigma公司;青霉素購(gòu)于華北制藥股份有限公司;烏拉坦購(gòu)于成都化學(xué)試劑廠;氯化鈉注射液購(gòu)于石家莊四藥有限公司。

1.2 皮層定位注射青霉素誘發(fā)癲癇模型的建立

將大鼠以烏拉坦(1.25 g/kg)腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀上，以前囟為零點(diǎn)，用牙科鉆在前囟向后2 mm，右旁開2 mm處行顱骨鉆孔，暴露出直徑為0.2－0.3 cm的硬腦膜，放置銀球懸浮記錄電極。采用RM6240C型多道生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄腦皮層電圖(EcoG)。待動(dòng)物清醒后(術(shù)后約4－5 h)，在前囟向后1 mm，左旁開1 mm，顱骨下1 mm處注射青霉素200 U，出現(xiàn)癇性發(fā)作并記錄到典型的棘波、尖波、棘慢波等癇性波，則模型建立成功。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

將144只大鼠隨機(jī)分為4組，每組36只。正常對(duì)照組:皮層注射生理鹽水2μl，30 min后腹腔注射生理鹽水2 ml，10 min后腹腔注射生理鹽水1 ml;癲癇模型組:皮層注射青霉素200 U，30 min后腹腔注射生理鹽水2 ml，10 min后腹腔注射生理鹽水1 ml;荷包牡丹堿+高牛磺酸處理組:皮層注射青霉素200 U，30 min后腹腔注射GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿7.5 mg/kg和GABAB受體阻斷劑高牛磺酸25 mg/kg，10 min后腹腔注射生理鹽水1 ml;荷包牡丹堿+高牛磺酸+蠅蕈醇處理組:皮層注射青霉素200 U，30 min后腹腔注射荷包牡丹堿7.5 mg/kg和高牛磺酸25 mg/kg，10 min 后腹腔注射蠅蕈醇 1.0 mg/kg。

1.4 觀察指標(biāo)

行為指標(biāo):參照Racine癇性行為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［11］，0級(jí):無反應(yīng)或抽搐停止;Ⅰ級(jí):節(jié)律性嘴或面部抽動(dòng);Ⅱ級(jí):點(diǎn)頭或甩尾;Ⅲ級(jí):單肢抽動(dòng);Ⅳ級(jí):多肢抽動(dòng)或強(qiáng)直;Ⅴ級(jí):全面性強(qiáng)直－陣攣發(fā)作。以出現(xiàn)Ⅰ－Ⅲ級(jí)為部分性發(fā)作，Ⅳ－Ⅴ級(jí)為全面性發(fā)作。癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間:以注射青霉素后出現(xiàn)癇樣放電到癇樣放電消失所需的時(shí)間為癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間，各組隨機(jī)抽取6只大鼠記錄癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間。

腦電指標(biāo):EcoG記錄參數(shù)如下:采集頻率1 000 Hz;掃描速度800 ms/div;靈敏度，1 mV;時(shí)間常數(shù)，0.4 s;濾波頻率10 Hz;低通濾波15 Hz。記錄各組大鼠ECoG癇樣放電，以各組大鼠發(fā)作高峰時(shí)段的腦電計(jì)算癇樣波頻率、振幅的平均值作為該大鼠癇樣放電指標(biāo)，以注射青霉素后出現(xiàn)癇樣放電到癇樣放電消失所需的時(shí)間為癲癇樣放電持續(xù)時(shí)間，各組隨機(jī)抽取6只大鼠腦電作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 激動(dòng)GABAC受體對(duì)癇性行為和發(fā)作持續(xù)時(shí)間的影響

表1顯示，癲癇模型組36只大鼠在注入青霉素后均出現(xiàn)Ⅰ－Ⅲ級(jí)發(fā)作。給予GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿和GABAB受體阻斷劑高牛磺酸后能明顯延長(zhǎng)大鼠癲癇發(fā)作的持續(xù)時(shí)間，36只動(dòng)物中有約88.9%的動(dòng)物發(fā)作級(jí)別增加，出現(xiàn)Ⅳ－Ⅴ級(jí)發(fā)作，與癲癇模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);與荷包牡丹堿+高牛磺酸處理組比較，給予蠅蕈醇激動(dòng)GABAC受體能顯著縮短大鼠癲癇發(fā)作的持續(xù)時(shí)間，降低發(fā)作級(jí)別，僅有19%的動(dòng)物出現(xiàn)Ⅳ－Ⅴ級(jí)發(fā)作(P＜0.05)。

表1 蠅蕈醇、荷包牡丹堿和高牛磺酸對(duì)青霉素誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間及行為的影響(±s)Table 1 Effects of muscimol，bicuculline and homotaurine on the duration and behavior of penicillin-induced seizures in rats(±s)

表1 蠅蕈醇、荷包牡丹堿和高牛磺酸對(duì)青霉素誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間及行為的影響(±s)Table 1 Effects of muscimol，bicuculline and homotaurine on the duration and behavior of penicillin-induced seizures in rats(±s)

與癲癇模型組比較，*P＜0.05;與荷包牡丹堿+高牛磺酸處理組比較，#P＜0.05;n1=6，n2=36

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2.2 激動(dòng)GABAC受體對(duì)EcoG癇樣放電持續(xù)時(shí)間、癇波頻率及最高振幅的影響

圖1和表2結(jié)果顯示，癲癇模型組在給予青霉素后，2－5 min內(nèi)開始記錄到棘波、尖波、棘慢波等癇樣波，放電持續(xù)時(shí)間為(72.8±6.3)min，發(fā)作高峰期癇樣波頻率為(43.4±5.5)/min，振幅為(3.0±0.6)mV。給予 GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿和GABAB受體阻斷劑高牛磺酸后放電持續(xù)時(shí)間、癇樣波頻率及振幅均顯著增高(P＜0.05)。給予蠅蕈醇激動(dòng)GABAC受體可顯著抑制GABAA和GABAB受體阻斷劑引起的放電持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.05)，并降低相同時(shí)間內(nèi)的癇樣波頻率和振幅，分別與癲癇模型組及荷包牡丹堿+高牛磺酸處理組相比，均有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 蠅蕈醇、荷包牡丹堿和高牛磺酸對(duì)青霉素誘發(fā)的大鼠癇樣放電的代表性EcoGFigure 1 Representative EcoGrecordings for the effects of muscimol，bicuculline and homotaurine on penicillin-induced epileptic discharges in rats

表2 蠅蕈醇、荷包牡丹堿和高牛磺酸對(duì)青霉素誘發(fā)的大鼠癇樣放電的持續(xù)時(shí)間、癇波頻率及振幅的影響(±s，n=6)Table 2 Effect of muscimol，bicuculline and homotaurine on duration，frequency and amplitude of penicillin-induced epileptic discharges in rats(±s，n=6)

表2 蠅蕈醇、荷包牡丹堿和高牛磺酸對(duì)青霉素誘發(fā)的大鼠癇樣放電的持續(xù)時(shí)間、癇波頻率及振幅的影響(±s，n=6)Table 2 Effect of muscimol，bicuculline and homotaurine on duration，frequency and amplitude of penicillin-induced epileptic discharges in rats(±s，n=6)

與癲癇模型組比較，*P＜0.05;與荷包牡丹堿+高牛磺酸處理組比較，#P＜0.05

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3 討論

青霉素是經(jīng)典的致癇劑，其通過拮抗GABAA受體，引起抑制性突觸活動(dòng)減弱或興奮性突觸活動(dòng)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增高［10，12］。本實(shí)驗(yàn)中，通過在大鼠大腦皮層一側(cè)運(yùn)動(dòng)區(qū)注射青霉素，成功制備了簡(jiǎn)單部分性發(fā)作模型，表現(xiàn)為點(diǎn)頭、甩尾、單肢抽動(dòng)(Ⅰ－Ⅲ級(jí))，EcoG出現(xiàn)明顯的癇性放電，特征為頻發(fā)的棘波和棘慢綜合波。

研究表明，GABAA受體位于中樞突觸后膜，GABA結(jié)合該受體打開氯離子通道產(chǎn)生抑制性突觸后電位進(jìn)而抑制神經(jīng)元放電，其介導(dǎo)了CNS大多數(shù)的快速抑制效應(yīng)，而GABAB受體則通過與G蛋白偶聯(lián)介導(dǎo)了慢的抑制效應(yīng)，二者均參與了內(nèi)源性的抗癲癇機(jī)制［13］。本實(shí)驗(yàn)在大鼠運(yùn)動(dòng)皮層定位注射青霉素誘發(fā)癲癇發(fā)作模型中發(fā)現(xiàn)，利用荷包牡丹堿和高牛磺酸阻斷GABAA和GABAB受體可使青霉素誘發(fā)癇性活動(dòng)進(jìn)一步增強(qiáng)，大部分大鼠出現(xiàn)陣攣發(fā)作，發(fā)作程度加重至Ⅳ－Ⅴ級(jí)，同時(shí)棘波頻率增快、振幅增大、發(fā)作持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)了近1倍。這一結(jié)果表明，阻斷GABAA和GABAB受體使得 CNS失去了由GABAA和GABAB受體介導(dǎo)的大多數(shù)抑制效應(yīng)。由于GABAC受體對(duì)前面兩種阻斷劑不敏感［9］，由它所介導(dǎo)的抑制作用并不受影響。

研究發(fā)現(xiàn)，GABAC受體介導(dǎo)的抑制作用可發(fā)生在突觸間隙低濃度的GABA作用下，而GABAA受體的激活需要高濃度的 GABA刺激，同時(shí)，與GABAA受體快激活快失活的特性不同，GABAC受體介導(dǎo)的抑制作用持續(xù)時(shí)程較長(zhǎng)，且不表現(xiàn)明顯的脫敏作用［8］。因此，當(dāng)突觸間隙GABA的濃度降低到一定值時(shí)，GABAA受體已無法承擔(dān)所應(yīng)維持的抑制強(qiáng)度，此時(shí)，GABAC受體介導(dǎo)的抑制作用便顯得必不可少。這些特殊的生理特性也意味著它所介導(dǎo)的抑制作用在CNS功能的調(diào)節(jié)中起著重要的作用［14］，但它具體是否參與調(diào)節(jié)癲癇的發(fā)作和終止尚不明確。在內(nèi)源性抗癲癇機(jī)制研究中蠅蕈醇已被廣泛的作為工具用藥使用。傳統(tǒng)上認(rèn)為蠅蕈醇為GABAA受體的選擇性激動(dòng)劑，但在GABA受體蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，蠅蕈堿同樣具有激活GABAC受體的活性［15］。GABAC受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此，蠅蕈醇激動(dòng)GABAC受體可改變大腦皮質(zhì)，海馬和小腦等多個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)在阻滯GABAA和GABAB受體的實(shí)驗(yàn)條件下，以蠅蕈醇作為工具藥激動(dòng)GABAC受體后，不但能對(duì)抗青霉素和GABAA及GABAB受體阻斷劑協(xié)同誘發(fā)的癲癇發(fā)作行為活動(dòng)，同時(shí)可明顯抑制異常腦電活動(dòng)，表現(xiàn)在顯著縮短發(fā)作持續(xù)時(shí)間、減少癇波發(fā)放頻率、降低癲癇波波幅，這一結(jié)果提示，GABAC受體激活能有效抑制癲癇樣放電，終止癲癇發(fā)作，是內(nèi)源性的抗癲癇機(jī)制之一，而該受體的抗癲癇作用可能與其生理特性密不可分。我們推測(cè)，癲癇發(fā)作時(shí)，當(dāng)GABAA和GABAB受體無法響應(yīng)其速效抑制作用或無法承擔(dān)所應(yīng)維持的抑制強(qiáng)度時(shí)，GABAC受體即啟動(dòng)緩慢而持久的抑制效應(yīng)，從而自行終止癲癇發(fā)作，機(jī)體的內(nèi)源性抗癲癇系統(tǒng)中可能存在“雙重保險(xiǎn)”機(jī)制。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了GABAC受體的激活是內(nèi)源性的抗癲癇機(jī)制之一，這將為癲癇的治療學(xué)和抗癲癇藥物的藥理學(xué)研究提供新的思路，但該受體所介導(dǎo)的具體抗癲癇機(jī)制還有待深入研究。

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