稀土離子Tb3+與阿霉素相互作用的光譜研究

王東新，郗曉云，李英奇

(1山西醫科大學公共衛生學院衛生化學教研室，太原 030001;2山西大學化學化工學院;*通訊作者，E-mail:wdx2002hx@aliyun.com)

阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX)是一種廣譜抗癌藥物，通過微生物方法合成的一種含糖苷的蒽環類抗生素，其結構見圖1。它的抗癌作用機制是能嵌入細胞的雙鏈DNA，抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用［1］。同時DOX也是很好的金屬螯合劑，研究表明DOX與Fe3+配位可加強DOX與DNA的作用，同時產生的自由基可引起DNA的氧化損傷，提高DOX的抗癌效率［2］。但是由于DOX具有較強的骨髓抑制作用和心臟毒性［3］，易使腫瘤細胞產生耐藥性，從而限制其臨床的應用。

動物體內的抑癌實驗和體外實驗證明稀土離子對肉瘤和化學致癌均有抑制作用［4，5］，稀土離子由于其離子半徑適中、電荷多，在體內易與各種蛋白配位，并有較差的細胞穿透性［6］，從而失去其抗癌功能。但是與一些易于穿透細胞膜，特別是核膜的配體配位后可加強其抗癌功能。稀土離子鋱(Tb3+)的配合物具有優異的熒光特性而便于對其進行光譜分析，近年來對Tb3+在生物體內的熒光成像研究較多［7］，但是 Tb3+與 DOX配合物的研究未見報道。本文主要使用光譜方法對Tb3+與DOX形成的配合物及其穩定性進行了研究，并對DOX-Tb3+配合物是否可提高DOX的抗癌作用進行了測定。

圖1 阿霉素結構示意Figure 1 The structure of DOX

1 材料與方法

1.1 材料

阿霉素(DOX，doxorubicin hydrochloride，深圳萬樂藥業有限公司，批號H44024359)，TbCl3(上海丹曦化工科技有限公司)，實驗用Hepes(pH 7.4)緩沖體系，噻唑藍(MTT，Sigma)，細胞培養基DMEM(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(Trypsin，Amresco)，EDTA(北京化工廠)，二甲基亞砜(DMSO，Amresco)，實驗中所用化學試劑均為分析純，細胞培養用水為三次蒸餾水，其他用水為一次蒸餾水，人肝癌細胞(HepG2細胞)由山西大學生物科學技術所提供。

1.2 儀器

水套式二氧化碳細胞培養箱(HF160W，上海力申科學儀器有限公司)，酶標儀(Model 550，美國Bio-rad公司)，紫外－可見分光光度計(Cary E-clipse，美國VARIAN公司)，熒光分光光度計(Cary Eclipse，美國VARIAN公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 DOX紫外可見吸收光譜的測定 室溫下，將DOX的Hepes溶液加入到1 cm比色皿中，以Hepes緩沖液為空白，繪制吸收光譜。測定480 nm處DOX的吸光度并依據其摩爾吸光系數確定其濃度(ε=11 500 L/(mol·cm))［8］。用 50 μl微量注射器向 DOX(5.0×10－5mol/L)的 Hepes(pH 7.4)溶液中逐量加入Tb3+溶液，搖勻，掃描光譜圖不變時為反應平衡，并記錄該光譜圖。

1.3.2 熒光光譜測定 室溫下，將 DOX的 Hepes溶平液加入到1 cm比色皿中，設定激發波長為480 nm，激發狹縫和發射狹縫均為10 nm，繪制500－750 nm的熒光光譜。同時逐量加入Tb3+溶液，搖勻，掃描光譜圖不變時為反應平衡，并記錄光譜圖。

1.3.3 DOX-Tb3+配合物穩定性的測定 將 DOX與Tb3+按1∶1的比例加入1 cm比色皿中，反應后掃描紫外可見吸收光譜，并分別加入氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸等)和EDTA觀察光譜的變化。

1.4 MTT比色法檢測細胞活性

HepG2細胞接種到含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養箱中培養，待細胞貼壁長滿至80%－90%滿時傳代。

取對數生長期的HepG2細胞懸液(7.5×103個細胞/mL)接種于96孔細胞培養板，每孔200μl，置于培養箱中培養16 h，待細胞完全貼壁后，分別加入5.1 μmol/L DOX、TbCl3和 DOX-Tb3+繼續培養24 h和48 h，以未處理的空白細胞為對照，每組實驗重復6次。反應結束后每孔加入20μl MTT(5 mg/mL)，37℃繼續培養4 h，棄上清，每孔加150μl DMSO，震蕩10 min，待結晶完全溶解，于490 nm下用酶標儀測定吸光度值(A)。按照如下公式計算細胞存活率:細胞存活率(%)=實驗組 A值/空白對照 A值×100%。

2 結果

2.1 DOX 與 Tb3+的作用

2.1.1 紫外吸收光譜 在pH為7.4的緩沖液中，DOX在480 nm附近處有一較寬的吸收帶，溶液為紅色，DOX的吸收光譜見圖2。DOX分子中的蒽環上的羥基和酮基上的氧與Tb3+配位，形成金屬配合物，使吸收光譜發生變化。實驗發現，Tb3+與DOX有較強的相互作用，隨著Tb3+的加入，DOX在480 nm處的寬吸收帶紅移，峰高降低;同時在538 nm和580 nm附近的吸光度升高，得到與DOX有明顯區別的吸收曲線(圖2)，溶液呈現紫色，當Tb3+達到一定濃度后，吸收光譜不再改變。采用光度滴定法進行測定，以480 nm處的吸光度對［Tb3+］/［DOX］摩爾比作圖，曲線具有明顯的拐點，可以確定Tb3+與DOX形成1∶1的穩定配合物(圖3)。

圖2 Tb3+滴定DOX的紫外－可見吸收光譜Figure 2 Ultraviolet-visible absorption spectra of DOX titrated by Tb3+

2.1.2 分子熒光光譜 以480 nm作為激發光激發下，DOX在595 nm處有最大熒光發射峰，560 nm有一個肩峰，用Tb3+滴定DOX溶液，記錄不同［Tb3+］/［DOX］摩爾比時的熒光光譜。實驗表明，隨著稀土離子Tb3+的加入，DOX的熒光強度均隨之減弱。當Tb3+達到一定濃度后，熒光光譜不再改變。不同濃度Tb3+滴定DOX的熒光光譜變化見圖4，結果顯示稀土離子Tb3+與DOX發生了作用，生成配合物，使分子的共軛體系發生改變，熒光效率降低。以595 nm的熒光強度對［Tb3+］/［DOX］摩爾比作圖(見圖5)，得到配合物的配比亦為［Tb3+］/［DOX］=1∶1。

圖3 DOX的吸光度隨［Tb3+］/［DOX］摩爾比的變化Figure 3 The absorbance of DOX at different molar ratio of［Tb3+］/［DOX］

圖4 Tb3+滴定DOX的熒光光譜Figure 4 The fluorescent spectra of DOX titrated by Tb3+

2.2 DOX和稀土離子配合物與氨基酸、EDTA的作用

為進一步了解稀土離子Tb3+與DOX的結合能力強弱，我們研究了在氨基酸和EDTA的滴加下DOX與稀土離子Tb3+配合物的光譜變化。氨基酸、EDTA與DOX本身不發生作用，但可與DOX分子競爭中心離子Tb3+，對DOX的稀土離子配合物有影響。實驗表明，氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸等)的加入對Tb3+-DOX的特征吸收曲線沒有明顯影響，其在580nm處附近的吸收帶無變化，說明這些氨基酸不能將Tb3+從DOX-Tb3+配合物中競爭下來;而強絡合劑EDTA的加入使DOX-Tb3+的特征吸收曲線發生變化，使其在580 nm處附近的吸收帶消失，而480 nm的吸光度升高(圖6，見第341頁)，顯示出游離DOX的特征吸收曲線，溶液的顏色也由紫色變成紅色，表明EDTA使DOX-Tb3+配合物解離。

圖5 Tb3+的加入對DOX在595 nm處熒光強度的變化Figure 5 The changes of the fluorescence intensity of DOX at 595 nm after titrating Tb3+

2.3 DOX-Tb3+配合物對細胞毒性的影響

MTT試驗是基于細胞水平測定毒性的方法，以HepG2細胞為模型，使用 MTT試驗分別測定了DOX、TbCl3和DOX-Tb3+配合物對細胞的存活率，由此可得出對細胞毒性的大小順序為TbCl3＜DOX＜DOX-Tb3+(見圖7)。實驗證明TbCl3對細胞的毒性較小，這可能是因為Tb3+具有較強的配位能力以及較差的細胞穿透性而難以發揮其功效。但是當DOX與Tb3+配位后對細胞的毒性比自由的DOX增大，差異具有統計學意義(P＜0.05，見圖7)，可能是DOX-Tb3+與DNA的作用比DOX本身增強，Tb3+的存在使DOX對細胞毒性起協同作用。

圖6 氨基酸和EDTA的滴加對DOX-Tb3+配合物吸光光譜的變化Figure 6 The changes of the absorbance spectra of DOX-Tb3+complex after titrating amino acid and EDTA

圖7 MTT法測定細胞的存活率Figure 7 The cell viability was determined by MTT assay

3 討論

DOX可與稀土離子Tb3+相互作用形成1∶1的穩定配合物，生物小分子如氨基酸等難以使配合物解離，只有強的絡合劑如 EDTA才能將其解離。DOX-Tb3+配合物可增加 DOX對癌細胞的毒性，Tb3+對DOX的細胞毒性起協同作用。

［1］王肇炎，陳正玉，賴清宏.阿霉素的臨床應用［M］.北京:人民衛生出版社，1993:2－10.

［2］章俊軍，鄒國林，呂利紅，等.阿霉素鐵(Ⅲ)配合物與DNA結合作用的研究［J］.生物物理學報，1999，15(1):19－24.

［3］Quiles Jl，Huertas JR，Battino M，etal.Antioxdant nutrients and adriamycin toxicity［J］.Toxicology，2002，180(1):79－95.

［4］王宗惠，蘇英，龐新民，等.混合硝酸稀土對人正常細胞及癌細胞生長作用的體外觀察［J］.衛生毒理學雜志，1994，8(3):197－199.

［5］王宗惠，龐新民，蘇英，等.稀土對小鼠腹腔巨噬細胞特異功能的作用影響［J］.衛生毒理學雜志，1994，8(3):220－221.

［6］Mohandessi S，Rajendran M，Magda D，etal.Cell-penetrating peptides as delivery vehicles for a protein－targeted terbium complex［J］.Chem Eur J，2012，18(35):10825－10829.

［7］Law GL，Wong KL，Man CWY，etal.Emissive terbium probe for multiphoton in vitro cell imaging［J］.J Am Chem Soc，2008，130(12):3714－3715.

［8］Chaires JB，Dattagupta N，Crothers DM.Self－association of daunomycin［J］.Biochemistry，1982，21(17):3927－3932.