同種異體骨髓間充質干細胞在大鼠體內心肌缺血微環境中Nav1.5的表達

張 靜，王亭忠，魏 峰，倪雅娟，馬愛群*

(1新疆醫科大學第四附屬醫院心臟中心，烏魯木齊 830000;2西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科;3西安交通大學醫學院第二附屬醫院心內科;*通訊作者，E-mail:maaiqun@medmail.com.cn)

通過MSCs移植修復或替代嚴重受損或壞死的心肌細胞來改善缺血性心臟病心臟功能、逆轉心肌重構已成為目前的研究熱點［1］。大量動物實驗［2－4］表明，心肌梗死區域 MSCs的局部移植可向心肌細胞分化，但也有研究［2］觀察到心肌梗死患者接受MSCs移植后會發生心律失常。心律失常的發生發展與心肌上離子通道的分化表達有重要關系，鈉離子通道對心肌細胞動作電位的產生、傳導和維持動作電位時程等起到重要作用。其中，Nav1.5是鈉離子通道孔形成的亞基單位，在心電活動中發揮重要作用［5］。該研究擬觀察同種異體的MSCs移植到大鼠體內心肌缺血微環境后Nav1.5的表達情況，為移植后心律失常發生的研究提供實驗基礎。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

80 g清潔級雄性SD大鼠1只，用于骨髓供體;180－200 g清潔級雄性SD大鼠50只，用于建立MI模型，均由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。

1.2 儀器及試劑

BL-420生物機能實驗系統購于成都泰盟科技有限公司，HM325石蠟切片機購于德國MICROM公司，激光顯微切割儀購于瑞士LEICA公司，BX51型正置光學顯微鏡購于日本Olympus公司，水合氯醛購于西安化學試劑廠，兔抗大鼠Nav1.5抗體購于美國Santa cruz公司，山羊抗兔IgG-Cy3購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MSCs的分離、標記及貼壁培養 采用Percoll’s密度梯度離心法結合貼壁培養法分離純化SD大鼠 MSCs，采用文獻［6］的方法，以攜帶 GFP的慢病毒載體轉染標記，將GFP標記的MSCs懸液以5×105/ml接種于培養瓶中，放在37℃的5%CO2培養箱中孵育。24h后更換培養基，加入新鮮的含10%FBS的DMEM培養基，每3－4 d換液一次，直到細胞占瓶底的80%或接近融合時，用0.25%的胰蛋白酶消化，直到細胞回縮成圓形，倒掉胰蛋白酶，向培養瓶中加入DMEM培養基，吸管吹打，待細胞從瓶壁上脫落后，平分為兩瓶，各加入新鮮的10%FBS，完成傳代培養。

1.3.2 MI模型的建立 100 g/L水合氯醛以3 ml/kg的劑量通過腹腔注射麻醉健康成年SD大鼠(n=50)，常規備皮、消毒、鋪巾，剪開皮膚，鈍性分離胸大肌和前鋸肌，用血管彎鉗穿透肋間肌進入胸腔并沿肋間隙方向撐開，另一血管彎鉗沿垂直肋間隙方向撐開肋骨，適當用力將心臟擠出，迅速在左心耳與肺動脈圓錐交界處平左心耳下緣2 mm處，以7/0無損傷縫合線結扎LAD近端，結扎后立即將心臟歸位并置入接注射器的引流管，對合皮膚的同時抽出胸腔內氣體約2 ml維持胸腔負壓，立即拔管并行胸外按壓，體表心電圖觀察有無急性心肌梗死后ST段抬高的心電圖改變，待心率、心律及呼吸正常且平穩后，縫合皮膚，術后連續3 d肌肉注射青霉素鈉。

1.3.3 GFP標記的MSCs的體內移植 將成功建立MI模型的42只大鼠2周后接受MSCs移植，采用建立MI模型的同樣方法麻醉、開胸、暴露心臟，用1 ml胰島素注射器于心肌梗死局部發白區即MI周邊區圓周分布均勻迅速注射6×106個MSCs(約0.15 ml細胞懸液)，注射后的心臟歸位等步驟同MI模型的建立。

1.3.4 心肌組織標本的提取 將再次成功建立移植模型的34只大鼠于移植后第3，5，7，9天分別隨機處死 10，10，10，4 只。第 3，5，7 天處死的 10 只中，5只用于免疫熒光染色，5只用于Real-time PCR法檢測，第9天處死的4只，用于TUNEL凋亡染色。

1.3.5 免疫熒光染色將第3，5，7天處死的大鼠心臟取出，沖洗，取注射部位的心肌組織，40 g/L多聚甲醛固定，200 ml/L蔗糖溶液脫水，OCT包埋，冰凍，連續組織切片，行常規免疫熒光染色;一抗濃度為兔抗大鼠Nav1.5(1∶100)，二抗濃度為Cy3標記的山羊抗兔(1∶100);激光共聚焦顯微鏡觀察其結果。

1.3.6 real-time PCR 檢測 同 1.3.5 中方法取出心臟，取注射部位的心肌組織，制備組織切片，方法同免疫熒光染色。應用激光顯微切割儀捕獲切片上GFP標記的MSCs，消化酶消化未移植的MSCs及各時間點的RNA，并行逆轉錄，反應條件為25℃，10 min;50℃，20 min;85℃，5 min;real time-PCR反應條件為50℃，2 min;95℃，2 min;95℃，15 s;60℃，30 s，5個循環，內參基因為甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)。采用2－ΔΔCt的方法分別計算其相對表達量。

1.3.7 TUNEL 凋亡染色 處死9 d 的大鼠，同1.3.5中方法取出心臟，取注射部位的心肌組織，方法同免疫熒光染色，將組織吸附到用多聚賴氨酸處理過的載玻片上制備組織切片;添加20μg/ml蛋白酶K稀釋液，室溫孵育;再次固定，滴入Equilibration緩沖液后滴加rTdT反應混合物同時覆蓋塑料蓋膜，37℃濕盒中孵育;避光環境下加入Streptavidin HRP稀釋液，室溫孵育，PBS沖洗后加入DAB稀釋液，室溫干燥;熒光顯微鏡結合光學顯微鏡觀察結果并拍照。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 GFP標記的MSCs的貼壁培養與標記

GFP標記的MSCs呈成纖維細胞樣的長梭形，貼壁生長，分布均勻，增殖速度較快(見圖1)。

圖1 GFP標記的MSCs的貼壁培養 (×600)Figure 1 Adherent culture of GFP-labeled MSCs(×600)

圖2 體內移植的GFP標記的MSCs及其免疫熒光染色(×600)Figure 2 The transplanted GFP-labeled MSCs in vivo and their immunofluorescence staining(×600)

2.2 移植的MSCs局部分布特點及Nav1.5的免疫熒光染色

通過免疫熒光顯微鏡觀察移植的GFP標記的MSCs，在心肌組織內排列方向與心肌細胞一致，呈帶狀分布(圖2A，見第1001頁)，通過Nav1.5的免疫熒光染色觀察到于移植后3，5，7 d均無Nav1.5的表達(見圖2B，見第1001頁)。

2.3 GFP標記的MSCs移植前后mRNA的表達

移植的MSCs上 Nav1.5 在移植后3，5，7 d之間比較及與未移植的MSCs相比，其相對表達量均無明顯變化(P＞0.05，見圖3)。

圖3 GFP標記的 MSCs移植前后 Nav1.5 mRNA相對表達量Figure 3 Relative expression of Nav1.5 mRNA before and after transplantation

圖4 移植的MSCs的TUNEL凋亡染色(×200)Figure 4 TUNEL staining of the transplanted MSCs(×200)

2.4 TUNEL 凋亡染色

移植的MSCs數量逐漸減少，移植后9 d，MSCs細胞數量明顯減少，移植區域行TUNEL凋亡染色示移植區域的GFP標記的MSCs在光鏡下呈棕褐色(圖4，箭頭所示，見第1001頁)。

3 討論

MSCs已成為移植領域的熱點細胞［7］，大量的動物實驗、臨床試驗已證實MSCs的移植可以修復壞死的心肌細胞從而改善心臟功能。有實驗證實移植的MSCs的分化具備環境誘導依賴性［8］。移植的MSCs所處環境是病態環境，周圍既有正常的心肌細胞，也有受損或異常的心肌細胞以及纖維瘢痕組織等，MSCs具有多向分化潛能，是否能夠向正常心肌細胞分化而具有正常心肌細胞的電生理特性有待證實。

電壓門控型鈉離子通道是維持心肌細胞電活動的主要離子通道之一，包括α和β兩個亞基［9］。其中，Nav1.5是鈉通道家族成員之一，是鈉通道的主要α亞基，具有鈉通道主要電生理特性，新近研究已證實許多心律失常的發生是由于Nav1.5不能正常分化表達而致心肌傳導功能障礙所引起［10］，如先天性或獲得性長QT綜合征、Brugada綜合征、擴張性心肌病、病態竇房結綜合征、心房顫動、心肌傳導功能障礙及嬰兒猝死綜合征等［11，12］。影響 Nav1.5分化表達的因素不單是離子通道本身，還包括其相互作用蛋白，通過復雜的分子和細胞學機制精確調節Nav1.5表達和生物學功能而影響其電生理特性［13］。本實驗證實移植的MSCs在體內心肌缺血微環境中不表達Nav1.5，其表達缺失是由于離子通道本身還是其相互作用蛋白的缺失所致尚不明確。本實驗小組前期研究結果表明移植的MSCs在體內心肌缺血微環境中可以表達cTnI、MYH、Cx43等心肌特異性標志物，說明移植的MSCs在形態學上朝心肌細胞方向分化，但本實驗結果提示移植的MSCs不能獲得正常心肌細胞的鈉離子通道的電生理特性，這可能會增加移植細胞與宿主心肌細胞間電生理偶聯的異質性，會引起心電活動的異常，從而導致心律失常的發生。

本實驗同時觀察到隨著移植時間的延長，移植的MSCs細胞數量逐漸減少，證實其在心肌缺血微環境中發生了凋亡，有動物試驗發現MSCs移植后24 h，50%以上的移植細胞發生了凋亡，1周后超過90%的移植細胞發生了凋亡［14］，推測微環境可能是影響MSCs凋亡的主要因素，其具體機制尚不明確，可能與移植區域周邊心肌細胞因壞死而產生肌纖維的斷裂、細胞間網格結構破壞及在微環境中缺乏足夠的營養能量供給等相關，局部注射的移植方法本身也可能使移植區域細胞分布不均勻，引起周圍炎癥細胞聚集發生急性炎癥反應致使移植細胞凋亡，其具體機制尚需進一步實驗證實。

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