siRNA沉默CEACAM1基因對人膠質瘤SHG44細胞生物學行為的作用

許剛柱，張 鵬，李 文，趙 慧，吳 濤，張俊鋒，王茂德

(1西安醫學院第一附屬醫院神經外科，西安710077;2西安醫學院臨床醫學院外科學教研室;3西安交通大學醫學院第一附屬醫院神經外科;*通訊作者，E-mail:xgz917@126.com)

腦膠質瘤的發病率位居顱內原發性腫瘤首位，呈惡性侵襲性發展，預后常較差。癌胚抗原相關細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)是癌胚抗原(CEA)基因家族成員之一，CEACAM1在多種腫瘤中可以影響其增殖、凋亡、侵襲及轉移等［1－3］。然而關于CEACAM1在膠質瘤中的作用還不十分清楚。本研究以CEACAM1基因作為靶點，設計針對CEACAM1基因的siRNA，轉染人膠質瘤SHG44細胞后觀察其對細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SHG44細胞由本實驗室保存。轉染試劑LipofectamineTM2000購自于Invitrogen公司。RPMI1640細胞培養液與胎牛血清(FBS)購自于HyClone公司，兔抗人CEACAM1單克隆抗體購自Epitomics公司。兔抗人β-catenin單克隆抗體和兔抗人Cyclin D1單克隆抗體北京中杉金橋公司。兔抗人GAPDH多克隆抗體購自賽諾博公司，CCK-8試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，HRP標記的羊抗兔IgG(H+L)二抗購自陜西先鋒生物科技有限公司，細胞周期檢測試劑盒購自Becton Dickinson(BD)公司，BCA蛋白定量試劑盒與ECL化學發光液購自PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設計與合成 根據GenBank登錄的CEACAM1基因序列(NM_001712.4)和RNAi的設計原則分別設計3段siRNA。①目標干擾位點1674－1696，設計正義鏈:5’－CAGCCACAGAAAUAAUUUATT－3’，反義鏈:5’－UAAAUUAUUUCUGUGGCUGTT－3’，命名為CEACAM1-siRNA1;②目標干擾位點2889－2911，設計正義鏈:5’－CUACCAUUCUAUUCCAUGUTT－3’，反 義 鏈:5’－ACAUGGAAUAGAAUGGUAGTT－3’，命名為 CEACAM1-siRNA2;③目標干擾位點 3130－3152，設 計 正 義 鏈:5’－CAGCCUCUGAAAUUUAUCUTT－3’，反義鏈:5’－AGAUAAAUUUCAGAGGCUGTT－3’，命名為 CEACAM1-siRNA3。siRNA序列經BLAST(http://nlm.nih.gov/BLAST/)檢索證實與CEACAM1以外的其他基因無同源性。另外設計一段不針對任何基因的siRNA序列作為陰性對照，正義鏈:5’－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3’，反義鏈:5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’。以上序列均由上海生物工程公司合成。

1.2.2 細胞培養與轉染 將SHG44細胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，5%CO2、37℃、飽和濕度條件下進行培養。將對數生長的SHG44細胞培養到96孔板中，待細胞密度達到70% 時，進行轉染，初期實驗分為5組:正常對照組(細胞未經任何處理)，陰性對照組(轉染非特異性siRNA)，CEACAM1-siRNA1組，CEACAM1-siRNA2組和 CEACAM1-siRNA3組。用LipofectamineTM2000作為轉染試劑，按siRNA轉染說明書操作，轉染后繼續培養48 h。

1.2.3 Westernblot法檢測 RNA 干擾對 CEACAM1及Wnt信號通路相關蛋白表達的影響 于轉染SHG44細胞48 h后，提取轉染細胞系的總蛋白，用BCA法測定蛋白含量，總蛋白在10%凝膠中電泳后，電轉至硝酸纖維素膜，封閉液(5%脫脂奶粉和0.05%Tween-20 TBS緩沖液)中4℃過夜;分別加入一抗CEACAM1單克隆抗體(1∶1 000)、β-catenin單克隆抗體(1∶1 000)和 Cyclin D1單克隆抗體(1∶1 000)及 GAPDH 多克隆抗體(1∶1 000)，室溫1 h，TBS-T洗膜3次，結合HRP標記的羊抗兔IgG(H+L)二抗1 h，TBS-T洗膜3次，ECL化學發光試劑檢測，計算機掃描圖像，測出各條帶面積灰度值。實驗重復3次取均值。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖 于轉染后將培養板在培養箱中分別孵育 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h，每組設5個復孔，然后向每孔加入10μl CCK-8溶液，再在培養箱內孵育2 h，用酶標儀在450 nm處檢測每組吸光度OD值。

1.2.5 流式細胞儀分析細胞周期 轉染48 h后用0.25%胰酶消化并收集各組細胞，PBS洗滌細胞1次，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入預冷的70%乙醇1 ml固定4℃環境下過夜。染色前用PBS洗1次，加入150μl RNaseA重懸細胞，37℃消化30 min。加100μl PI(50μg/ml)染液染色30 min，流式細胞儀檢測并計算細胞周期的分布率。

1.2.6 Transwell小室檢測細胞遷移能力 轉染后48 h胰酶消化各組細胞，無血清培養基重懸后稀釋成1×106個/ml，將100μl細胞懸液接種于Transwell小室上層，下室中加入含10%FBS的DMEM高糖培養基。37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24 h，取出上室，用濕棉簽輕輕擦拭掉未穿過膜的細胞，4% 多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色。用蒸餾水沖凈浮色，顯微鏡(×200)下計數穿過濾膜細胞數。

1.2.7 細胞體外侵襲實驗 用50 mg/L Matrigel處理Transwell小室的聚碳酸濾膜(濾膜孔徑為8 μm)小室底部膜的上室面，并在室溫下過夜干燥。轉染后48 h胰酶消化各組細胞，無血清培養基重懸調整細胞濃度為1×106個/ml，吸取100μl細胞懸液加至Transwell小室上室，下室加入600μl完全培養液，37℃、5%CO2條件下繼續培養24 h，用棉簽擦去濾膜上層細胞，4%多聚甲醛固定30 min，行結晶紫染色，顯微鏡(×200)下計數穿過濾膜細胞數。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 轉染后CEACAM1蛋白在SHG44細胞中的表達

轉染48 h后Western blot結果顯示，siRNA轉染組CEACAM1蛋白水平低于正常對照組和陰性對照組，其中CEACAM1-siRNA3轉染后CEACAM1降低最為明顯，分別測定各條帶灰度值，計算出CEACAM1-siRNA1、CEACAM1-siRNA2 和 CEACAM1-siRNA3細胞中CEACAM1蛋白表達抑制率分別為31.7%，41.2%和73.6%，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01，見圖1)。根據Western blot結果，選擇CEACAM1-siRNA3沉默CEACAM1基因的表達，進行后續試驗，實驗分為3組:正常對照組(細胞未經任何處理)、陰性對照組(轉染非特異性siRNA)、CEACAM1-siRNA組(轉染CEACAM1-siRNA3)。

2.2 siRNA對SHG44細胞增殖的影響

CCK-8細胞增殖實驗檢測結果提示，轉染48 h后CEACAM1-siRNA組與正常對照組及陰性對照組比較，細胞生長明顯受到抑制，差異有統計學意義(P＜0.05，見表1)。

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期

流式細胞術檢測細胞周期時相分布，結果發現:正常對照組和陰性對照組細胞在G0/G1期、S期、G2/M期所占比例接近，差異無統計學意義(P＞0.05);CEACAM1-siRNA組的G0/G1期細胞比例增多、S期細胞比例減少，與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05，見表2)，表明CEACAM1-siRNA誘導SHG44細胞出現G0/G1期阻滯。

圖1 siRNA對SHG44細胞CEACAM1蛋白表達的影響Figure 1 Effect of siRNA on the CEACAM1 protein expression in SHG44 cells

表1 siRNA下調CEACAM1對SHG44細胞增殖的影響(±s，%)Table 1 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on proliferation of SHG44 cells(±s，%)

表1 siRNA下調CEACAM1對SHG44細胞增殖的影響(±s，%)Table 1 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on proliferation of SHG44 cells(±s，%)

與正常對照組比較，*P＜0.05

CEACAM1-siRNA 組 0.226±0.023 0.227±0.022 0.253±0.029 0.408±0.015* 0.612±0.017*

表2 siRNA下調CEACAM1對SHG44細胞周期的影響(±s，%)Table 2 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on cell cycle of SHG44 cells(±s，%)

表2 siRNA下調CEACAM1對SHG44細胞周期的影響(±s，%)Table 2 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on cell cycle of SHG44 cells(±s，%)

與正常對照組比較，*P＜0.05

CEACAM1-siRNA 52.6±1.835.1±1.612.4±0.8

2.4 細胞遷移實驗結果

正常對照組、陰性對照組以及 CEACAM1-siRNA組SHG44細胞遷移數目分別為70.32±3.36、68.28±5.64 和 32.30±4.28，CEACAM1-siRNA組遷移平均細胞數顯著低于正常對照組、陰性對照組(P＜0.05);而兩組對照組之間，差異無顯著性(P=0.221)，提示siRNA沉默CEACAM1基因表達后可以顯著抑制SHG44細胞遷移能力。

2.5 細胞侵襲實驗結果

正常對照組、陰性對照組以及CEACAM1-siRNA組SHG44細胞穿膜數目分別為:25.36±4.38、23.19±3.62 和 12.72±3.57，CEACAM1-siRNA 組穿膜細胞數較正常對照和陰性對照組穿膜細胞數顯著減少(P＜0.05)，其相對侵襲力僅為空白對照組的50.3%，說明 CEACAM1表達下調可以抑制SHG44細胞的體外侵襲能力。

2.6 siRNA對Wnt信號通路相關蛋白β-catenin和Cyclin D1表達的影響

Western blot結果顯示，CEACAM1-siRNA組中β-catenin和Cyclin D1的蛋白水平與正常對照組比較明顯下降，正常對照組和陰性對照組之間的差異無統計學意義(見圖2)。

圖2 siRNA對SHG44細胞β-catenin和Cyclin D1表達的影響Figure 2 Effect of siRNA transfection onβ-catenin and Cyclin D1 protein expression in SHG44 cells

3 討論

膠質瘤多呈侵襲性生長，不易完全切除，且多數惡性膠質瘤細胞對放療及化療不敏感，臨床治療效果較差，所以探索新的治療方法具有極其重要的臨床意義。CEACAM1的生物學功能十分復雜，在不同腫瘤中的作用也不盡相同，甚至呈現相反的作用［1－3］:CEACAM1在多種腫瘤如前列腺癌、肝癌、結腸癌和膀胱癌中的表達普遍下降，故被認為是一種腫瘤抑制因子［4－7］;但在舌癌、肺癌、胰腺癌、膠質瘤和惡性黑色素瘤中CEACAM1表達增加，有可能促進惡性腫瘤的進展和遷移［8－12］。

目前國內外有關膠質瘤中CEACAM1的研究相對較少，在SHG44細胞株中的表達及其與細胞增殖、遷移及侵襲的關系也未見報道。本課題組前期研究［11］通過免疫組織化學的方法，檢測了人腦膠質瘤中 CEACAM1的表達情況，發現在膠質瘤中CEACAM1可能是一個促進腫瘤發生、發展的因素。因此，本研究旨在利用siRNA技術進一步探討CEACAM1對膠質瘤SHG44細胞生物學行為的影響，結果表明沉默CEACAM1表達可能是治療腦膠質瘤一種新的有效途徑。

本實驗通過體外化學合成針對CEACAM1基因設計的siRNA序列，轉染后48 h與正常對照組及陰性對照組相比，干擾組CEACAM1的表達明顯下降，提示所設計siRNA序列可以特異性地降低CEACAM1在膠質瘤細胞中的表達，用CCK-8法檢測轉染前后細胞增殖的影響，發現干擾后SHG44細胞生長顯著慢于正常對照組和陰性對照組，提示在膠質瘤中CEACAM1可能促進腫瘤細胞增殖，這與舌癌、肺癌、胰腺癌和惡性黑色素瘤中報道的CEACAM1 效應一致［8－10，12］。流式細胞儀檢測結果發現:CEACAM1的表達抑制使細胞周期停滯在G0/G1，導致SHG44細胞中G0/G1期細胞增加，S期和G2/M期細胞減少。β-catenin、Cyclin D1是 Wnt信號通路的重要組成成分，具有調節細胞增殖、抑制細胞分化及調控細胞周期等重要作用［13］。Western blot結果顯示 CEACAM1-siRNA組中 β-catenin和Cyclin D1的蛋白水平明顯下降(圖2)，進一步說明干擾CEACAM1基因表達可以延緩細胞周期進程，抑制細胞增殖。作為β-catenin的目標蛋白之一，Cyclin D1在SHG44和BT325膠質瘤細胞進入G1期的早期發揮著重要的生物學作用［14］，在腫瘤細胞中，由于β-catenin的表達增加，降解減少，從而在腫瘤細胞內蓄積，激活Cyclin D1基因的轉錄和翻譯過程，使得腫瘤細胞內的Cyclin D1蛋白含量上升，從而促進細胞周期G1/S期之間的轉換，促進腫瘤細胞的周期進程和增殖［15］。有研究表明，CEACAM1作為一個細胞活動中的重要調節因子，可以通過Wnt信號通路促進腫瘤進展和血管發生［16］，而膠質瘤的發生、發展也與Wnt信號系統激活密切相關［17］，本實驗研究結果表明 CEACAM1-siRNA抑制膠質瘤細胞增殖的作用可能是通過下調Wnt信號通路中的靶基因β-catenin和Cyclin D1的表達實現的。

浸潤和轉移是惡性腫瘤的重要生物學特征之一，也是導致腫瘤患者死亡的主要原因，而腫瘤細胞的遷移及侵襲則是腫瘤浸潤和轉移的必要條件。在肺癌［18］、胃癌［19］中 CEACAM1 的高表達使得癌細胞更易于轉移;在肝母細胞瘤患者［20］及鼠類畸胎癌細胞株(F9DR)［21］中CEACAM1表達的缺失則可能促進了轉移;在甲狀腺癌中CEACAM1表現為限制腫瘤生長，但卻增加轉移侵襲的機會［22］。以前認為結腸癌中CEACAM1缺失有利于腫瘤發生［23］，但最近的研究［24］卻認為結腸直腸癌中CEACAM1過表達與臨床分期密切相關，CEACAM1-L表達與結直腸癌病人的腫瘤轉移和較短的生存明顯相關，且通過劃痕實驗及侵襲小室實驗表明CEACAM1再次表達，說明CEACAM1-L促進了遷移和侵襲。以上各項研究說明不同腫瘤中CEACAM1的角色并不一樣。本研究通過Transwell小室實驗觀察SHG44細胞的遷移和侵襲能力的改變，結果顯示，與正常對照組和陰性對照組比較，干擾組SHG44細胞遷移及穿膜的數目降低，說明CEACAM1-siRNA能顯著抑制SHG44細胞的體外遷移及侵襲能力，實驗結果相似于最近在結腸癌細胞中的研究結論:CEACAM1可以借助調節N－鈣黏蛋白的表達抑制結腸癌的細胞與基質黏附，促進細胞遷移［25］。在 SHG44細胞中下調CEACAM1的表達抑制腫瘤細胞遷移及侵襲能力的確切機制還有待于進一步的研究。

總之，本研究通過siRNA技術下調SHG44細胞中CEACAM1的表達，觀察到SHG44細胞增殖減慢，細胞周期阻滯在G0/G1期，體外遷移和侵襲能力下降，結果提示CEACAM1有望成為一個膠質瘤的分子治療靶點。

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