補體過度激活在應激致早期流產及宮內發育遲緩中的作用

黨慧敏，劉艷巧*，吳曉玲，劉潤俠，安 鵬

(1西安交通大學第二附屬醫院中醫科，西安 710004;2西安交通大學第二附屬醫院婦產科;*通訊作者，E-mail:liuyanqiao@sohu.com)

應激(stress)是指機體在受到各種內外環境刺激時所出現的非特異性全身反應，其對于生殖能夠產生較為不利的影響，通常都與妊娠失敗密切相關且還會影響子代的健康［1，2］，以往對聲波應激模型研究表明，圍著床期接受應激后會使流產率增加［3］，而其可能的機制與母胎界面的炎性細胞募集等有關［4］;胚胎是一種半同種異體移植物，但大多數都不被母體免疫系統所排斥，而是維持至分娩，即母胎免疫耐受［5］，而補體系統對于適應性免疫具有調節作用［6］，活化的補體成分如C3a、C5a等可趨化招募炎性細胞，炎性細胞經可溶性血管內皮生長因子受體(fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-t)途徑如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達下降導致胎盤發育不足，發生胚胎損傷，導致復發性自然流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)及宮內發育遲緩(intrauterine growth restriction，IUGR)的發生［7］。CBA/J(雌)×DBA/2J(雄)小鼠為國際上公認的自發性流產經典模型，與人類RSA臨床表現類似，本文以其為研究對象，明確補體激活在應激后自發性流產孕鼠早期流產及胎兒宮內發育遲緩中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

選擇8周齡未經產雌性CBA/J小鼠80只，雄性DBA/2J小鼠30只及BALB/c小鼠10只，體質量18-22 g，均購自北京華阜康實驗動物中心，并飼養于SPF級環境中。將雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2J及BALB/c小鼠按2∶1于前晚6∶00合籠，次日晨8∶00用鑷子檢查陰栓，可見陰栓者即為妊娠0.5 d，雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2J小鼠合籠后成功受孕57只，受孕率為95%，將成功受孕的自然流產模型CBA/J(雌)×DBA/2J(雄)孕鼠編號后按隨機化原則分為模型組、低應激組及高應激組，每組各19只。雌性CBA/J小鼠與雄性BALB/c小鼠合籠后成功受孕20只，設為正常對照組，模型組小鼠平均周齡(7.32± 0.82)周，平均體質量(19.89±1.38)g。高應激組平均周齡(7.58±0.69)周，平均體質量(20.30±1.23)g。低應激組平均周齡(7.42±0.77)周，平均體質量(20.05±1.32)g。對照組平均周齡(7.55±0.60)周，平均體質量(20.28±1.28)g。各組小鼠年齡及體質量差異無統計學意義。

1.2 干預方法

參照Blois等［8］聲波應激模型方法，低應激組孕鼠于妊娠5.5 d給予持續24 h聲頻為460 Hz，1 s/次，間隔14 s(由 Mathworks Matlab R2009a軟件控制)，分貝強度為88 dB(由優利德電子(上海)有限公司生產UT351分貝測量儀測定)的聲波刺激;高應激組孕鼠于妊娠5.5 d給予持續24 h聲頻為460 Hz，5 s/次，間隔 10 s，分貝強度為 88 dB 的聲波刺激;對照組及模型組孕鼠均不接受任何聲波刺激。

1.3 檢測指標

將各組孕鼠分為兩批取材，首先于妊娠7.5 d對各組孕鼠各14只行眶下靜脈取血2 ml，檢測其血清C3a及VEGF、sFlt-1水平，同時留取各組孕鼠胎盤蛻膜組織測定VEGF蛋白表達水平;最后于妊娠13.5 d處死對照組孕鼠6只及模型組、低、高應激組孕鼠各5只，分別記錄活胎數、死胎數，稱重胚胎質量，并計算胚胎吸收率。

1.3.1 血清C3a及VEGF、sFlt-1檢測 將各組孕鼠2 ml靜脈血1 500 r/min離心5 min后取上清，采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測所采集血清標本的C3a、VEGF、sFlt-1水平，操作按試劑盒(購自福州藍圖生物科技有限公司)的說明書進行;根據吸光度及標準曲線換算小鼠血清C3a、VEGF及sFlt-1質量濃度。

1.3.2 蛻膜組織VEGF蛋白表達測定 將各組孕鼠胎盤蛻膜組織固定于0.01 mg/ml甲醛中，經常規脫水、石蠟包埋，4μm連續切片后，常規脫蠟，梯度酒精中浸泡，滴加3%的雙氧水15 min以滅活內源性酶;熱修復抗原;滴加兔抗VEGF多克隆抗體(一抗，滴度1∶100，Abcam公司生產)，4℃孵育過夜;滴加有辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體(二抗，北京中杉金橋生物有限公司生產)，37℃孵育45 min，DBA顯色，鏡下控制反應時間，顯色后脫水，透明，封片。光鏡下觀察，VEGF表達陽性為棕黃色顆粒。陰性對照用PBS代替一抗，其他步驟相同。選取同批染色切片，每張切片在光鏡下隨機取5個不同視野，以切片染色的背景作對照，用OLYMPUS CX31病理圖文分析系統測定陽性信號的積分光密度(integral optical density，IOD)值，以此反映組織切片中相應陽性物質的相對表達量。

1.3.3 胚胎吸收率及重量測定 將各組孕鼠于麻醉處死后記錄活胎數、死胎數，稱重胚胎質量，并計算胚胎吸收率［胚胎吸收率=死胎數/(活胎數+死胎數)×100%］。

死胎判斷標準［9］:丟失胚胎為體積明顯縮小，或失去正常胚胎形狀，胎兒胎盤單位顏色暗紅，母胎界面有出血水腫。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠胚胎吸收率、胚胎重量的比較

將各組孕鼠處死后，觀察并記錄其子宮、胚胎、胎盤、羊膜囊的情況。正常對照組(圖1A，見第1001頁)可見正常胚胎粗大如串珠狀，胚胎呈淡紅色，胚胎體積及形態正常，母胎界面無出血及水腫;應激組(圖1B、1C，見第1001頁)可見羊膜囊較小，胎兒胎盤單位顏色暗紅，母胎界面有明顯出血或可見部分子宮呈竹節樣改變，胚胎呈黑褐色，僅見到胚胎著床點，胚胎已完全或部分消失。

圖1 丟失胚胎的判定(妊娠13.5 d)Figure 1 Macroscopic evaluation of fetal loss(gestational 13.5 d)

圖2 免疫組織化學檢測各實驗組蛻膜組織的VEGF表達水平(×400)Figure 2 Expression of VEGF in decidual tissue by immunohistochemistry(×400)

我們進一步分析各組胚胎吸收率和胚胎重量，結果顯示:相比對照組，模型組胚胎吸收率明顯升高;低、高應激組與模型組分別相比較，其胚胎吸收率均明顯升高;且高應激組與低應激組相比，胚胎吸收率明顯增高，各組間差異均有統計學意義(均P＜0.05，見表1)。各組胚胎重量相比較，模型組顯著低于對照組;模型組胚胎重量值高于低、高應激組，差異有統計學意義;高應激組與低應激組相比，其胚胎重量明顯下降，各組間差異有統計學意義(均P＜0.05)。

表1 各組胚胎吸收率及胚胎重量的比較Table 1 Comparison of embryo absorption rate and embryo weight among four groups

2.2 各組小鼠血清C3a、VEGF和sFlt-1水平的比較

各組血清C3a及sFlt-1水平相比較，模型組均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05，見表2);各應激組與模型組相比，其血清C3a及sFlt-1水平均顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05);而高應激組血清C3a及sFlt-1水平均明顯高于低應激組，差異有統計學意義(P＜0.05)。同時，各組血清VEGF水平相比，模型組低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，應激組其血清VEGF水平相比模型組均明顯下降(P＜0.05)，高應激組血清VEGF水平相比低應激組顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 各組血清C3a、VEGF及sFlt－1水平的比較(±s)Table 2 Comparison of serum C3a，VEGF and sFlt－1 levels among four groups(±s)

表2 各組血清C3a、VEGF及sFlt－1水平的比較(±s)Table 2 Comparison of serum C3a，VEGF and sFlt－1 levels among four groups(±s)

與對照組比較，ΔP＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05;與低應激組比較，*P＜0.05

高應激組 201.16±103.2523.55±7.172 797.00±396.57

2.3 各組小鼠蛻膜VEGF蛋白表達水平的比較

在各組小鼠蛻膜中，VEGF主要表達于腺上皮細胞和血管內皮細胞胞質中(圖2，見第1002頁)，模型組小鼠蛻膜VEGF陽性染色明顯低于正常對照組，組間表達差異有統計學意義(P＜0.05)，應激后自然流產小鼠蛻膜VEGF積分光密度值相比模型組明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.05)，其中高應激組小鼠蛻膜VEGF表達水平與低應激組比較明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05，見表3)。

表3 各組蛻膜VEGF表達水平的比較(±s)Table 3 Comparison of decidual VEGF expression levels among four groups(±s)

表3 各組蛻膜VEGF表達水平的比較(±s)Table 3 Comparison of decidual VEGF expression levels among four groups(±s)

與對照組比較，ΔP＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05;與低應激組比較，*P＜0.05

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3 討論

固有免疫系統為抵御外源性微生物侵害機體的第一道防線，補體是固有免疫的重要組成成員。補體系統經經典途徑、旁路途徑、甘露糖結合凝集素(MBL)途徑所激活，形成C3轉化酶，將C3分解為C3a和C3b，C3a脫落進入體液，而C3b分別與C4b2b和C3bBb結合組成C5轉化酶C4b3b2b和C3b3bBb，進而形成攻膜復合物(MAC)［10］。活化C5a和 C3a是強烈的過敏性毒素，可招募激活炎性細胞，導致或增強炎癥反應。相關研究發現，CBA/J(雌)×DBA/2J(雄)自然流產模型小鼠胚胎吸收率明顯較正常對照組高，胎盤及存活胚胎的重量顯著低于正常組;胚胎殘骸、胎盤及蛻膜的單核細胞有大量C3沉著，炎性細胞的浸入。補體抑制劑Crry-Ig或B因子敲除或抗B因子抗體處理后均可顯著降低胚胎吸收率、胚胎重量增長，減少C3的沉著和炎性細胞的浸潤，與正常組無差異，表明RSA及IUGR發生與補體異常激活密切相關［11，12］。本研究結果顯示，自發流產模型組孕鼠胚胎吸收率相比正常對照組明顯升高，胚胎重量低于對照組，同時血清C3a水平較對照組明顯升高，亦證明自然流產及IUGR的發病與補體異常激活關系密切。

近年來研究顯示，補體異常激活可通過sFlt-1途徑導致RSA的發生。胎盤正常發育依賴于血管內皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(PIGF)及相應的受體，體內外研究發現，補體異常激活型RSA可能與血管生成因子紊亂有關，sFlt-1具有血管內皮生長因子受體Ⅰ樣結合VEGF的能力，但無生物學功能，具有強烈的抗血管生成作用［13］。自然流產模型小鼠血清游離VEGF水平明顯低于正常組，不足以滿足妊娠的需求，而流產組sFlt-1較對照組明顯升高;流產組經補體抑制劑Crry-Ig處理，可阻止sFlt-1升高，游離VEGF水平與對照組相當，妊娠得以維持，且胚胎重量相比自然流產明顯升高，表明sFlt-1升高是補體異常激活的結果，是RSA及IUGR的重要機制。本研究結果表明，模型組相比正常組血清sFlt-1升高，血清VEGF水平下降同時胎盤蛻膜VEGF表達減少，影響胚胎原始血管形成、胚胎發育、胎盤形成等過程，從而導致RSA及IUGR的發生。

研究表明，軀體或心理的應激都會使神經、內分泌及免疫系統受到影響，而這些系統的平衡正是妊娠維持所必需的，在通常狀態下，細胞應激或組織受損，細胞里一般就會釋放一些分子并且與固有免疫細胞表面上的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)相結合，進而引發炎性反應［14］，通過研究接受應激后的小鼠模型表明，其成熟的子宮樹突狀細胞數目增長，子宮引流淋巴結中Treg細胞下降，并且分泌炎性細胞因子如TNF-α、IFN-γ的Th1細胞克隆擴增增長，從而嚴重影響了胚胎耐受［15］，其中精神應激不但能夠導致不孕而且能導致流產，有研究表明聲波應激能夠導致妊娠早期同種異體胚胎的丟失，可能與其導致Th1/Th2比值升高有關［16］，其能夠減少高和低胚胎丟失模型鼠中大血管分布密度，在高胚胎丟失模型中，聲波應激可使表達VCAM-1的血管分布顯著增加［17］。通過本研究結果顯示，接受聲波應激后自然流產孕鼠相比較模型組，胚胎吸收率明顯升高，存活胚胎重量進一步下降，同時血清C3a及sFlt-1水平異常增高，且升高水平與其接受應激的強度呈正比，血清VEGF水平及蛻膜VEGF表達顯著下降，分析其導致高胚胎流失率并加劇IUGR發生的作用機制可能與應激導致補體過度活化產生過多的C3a趨化激活中性粒細胞或單核細胞，激活的中性粒細胞或單核細胞經sFlt途徑導致胎盤蛻膜VEGF表達減少，胎盤血管形成不足，血管重塑障礙有關，且病情程度與應激程度呈正相關。

總之，本研究證實補體異常激活在應激致RSA早期流產、IUGR中均發揮重要作用，不同程度的應激刺激導致補體系統經經典途徑或旁路途徑異常激活，且活化的程度與其受應激的強度成正比，異常活化的補體成分趨化招募炎性細胞，炎性細胞經sFlt途徑導致胎盤發育不足導致胚胎損傷，導致早期流產及IUGR發生，而應激導致補體過度活化等具體機制有待進一步研究。

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