非小細胞肺癌患者血清游離DNA定量檢測的臨床意義

張世強，王保慶，王海清，張旭東

(1徐州醫學院第二附屬醫院放療三科，徐州 221006;2徐州醫學院第二附屬醫院腫瘤內科;3徐州醫學院第二附屬醫院呼吸內科;*通訊作者，E-mail:13952234612@163.com)

惡性腫瘤患者的血清中有大量的游離DNA存在，其含量約為健康人的10倍以上，研究［1－3］表明，在腫瘤的生長過程中，腫瘤細胞不斷釋放DNA進入外周血液，這類血清游離DNA的遺傳特性與腫瘤細胞基因組DNA相同。國外學者通過檢測肺癌患者血清游離DNA中的特定突變基因，指導臨床個體化靶向治療已經取得較好的臨床療效［4－6］，因此，血清游離DNA的檢測在惡性腫瘤的診斷和治療中具有重要的應用價值。本研究以非小細胞肺癌患者為研究對象，通過分析非小細胞肺癌患者治療前后血清游離DNA水平的變化，以期為血清游離DNA水平在肺癌臨床診治中的推廣應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2013－05～2014－03收治的非小細胞肺癌患者65例，年齡41－74歲，中位年齡51.9歲;所有患者均有細胞病理學證據確診，其中:I期8例、Ⅱ期24例、Ⅲ期18例、Ⅳ期15例;鱗癌34例、腺癌31例。32例Ⅰ－Ⅱ期的患者均采取手術治療，33例Ⅲ－Ⅳ期患者采取相同的化療方案治療，同時收集健康志愿者60例作為對照組，年齡39－64歲，中位年齡44歲。所有研究對象均簽署知情同意書，治療前均排除肝炎、糖尿病、慢性炎癥、高血脂及免疫性疾病史。

1.2 外周血樣本采集及血清DNA提取

分別抽取檢測對象前臂靜脈血4 ml(肺癌患者在手術和化療前后進行抽血)。室溫放置2 h后用低溫高速離心機將靜脈血離心(20℃，3 000 r/min，10 min)，棄下液，取上層液血清1 ml放置入2 ml凍存試管，然后將血清置于－80℃冰箱保存備用。血清DNA以磁珠法全血基因組DNA抽提試劑盒(美國Omega公司生產)抽提，按說明書所述的方法抽提血清DNA。

1.3 血清游離DNA定量

參照文獻［6］應用熒光定量PCR進行血清游離DNA的定量，設計表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)引物和熒光定量 PCR檢測EGFR胞質區外顯子28編碼引物序列如下:上游引物:5’－CCTGTCATAAGTCTCCTTGTTGAG－3’，下游引物:5’－CAGTCTGTGGGTCTAAGAGCTAATG－3’，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。取2μl DNA進行定量PCR檢測，血清游離DNA含量(單位:拷貝數/ml血清)按以下公式計算:C=Q×(VDNA/VPCR)×(1/Vext)，公式中 C為 EGFR拷貝數、Q為CPD(cytoplasmic domain)拷貝數、VDNA為DNA抽提后的體積(20μl)、VPCR為定量PCR檢測時加入的DNA量(2μl)、Vext為用于抽提 DNA的血清體積(ml)。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 肺癌組及健康對照組血漿游離DNA水平比較

實驗結果表明，65例非小細胞肺癌組血漿游離DNA 水平為(165.2±41.6)ng/ml，健康對照組血漿游離DNA水平為(13.8±6.3)ng/ml，肺癌組明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P＜0.01，見表1)。

2.2 血漿游離DNA水平與肺癌臨床病理特征的關系

肺癌組患者按照腫瘤大小、病理類型及臨床分期進一步分組，結果表明，腫瘤直徑＞3 cm的患者血漿游離DNA水平明顯高于腫瘤直徑＜3 cm的肺癌患者，差異具有統計學意義(P＜0.01)，同時Ⅲ－Ⅳ期的患者血漿游離DNA水平明顯高于Ⅰ－Ⅱ期的肺癌患者，兩者之間差異亦有統計學意義(P＜0.01)，而按照病理分型分組比較，鱗癌組與腺癌組的患者血漿DNA水平差異無顯著性(P＞0.05，見表2)，提示肺癌患者血漿游離DNA水平與腫瘤負荷及臨床分期有密切的關系，但與肺癌患者的病理分型無明顯相關性。

表1 肺癌組以及對照組血漿游離DNA水平 (ng/ml)Table 1 Level of plasma DNA in lung cancer group and control group (ng/ml)

表2 血漿游離DNA水平與NSCLC臨床病理特征的關系 (ng/ml)Table 2 Relationship between plasma DNA level and clinical pathological features of NSCLC (ng/ml)

2.3 血漿游離DNA水平與肺癌療效的關系

32例患者采取手術治療，其術后血漿游離DNA水平較術前顯著性下降，與術前比較差異具有顯著性(P＜0.01，見表3)，可能與患者術后體內腫瘤細胞負荷減少有關;另外，33例肺癌患者采取相同的化療方案治療，化療有效的患者，其血漿游離DNA水平在化療后明顯下降，差異具有統計學意義(P＜0.01)，而化療無效的患者，其血漿游離DNA水平在化療后雖有一定程度的下降，但統計分析差異無顯著性(P＜0.01)，進一步對兩組患者化療后比較發現，化療有效的肺癌患者血漿游離DNA水平顯著低于化療無效的患者(P＜0.01)，提示血漿游離DNA水平治療前后的變化可作為肺癌患者臨床療效的判斷指標。

3 討論

血清游離DNA是一種存在于體液中的游離狀態的脫氧核糖核酸，正常人的外周血游離DNA來源于淋巴細胞或其他有核細胞，腫瘤患者的外周血游離DNA主要來源于腫瘤細胞的壞死或凋亡、循環腫瘤細胞裂解所釋放，血清游離DNA與惡性腫瘤組織DNA具有相同的遺傳變異特性［7］。眾多研究表明［8－11］，血清游離DNA含量的檢測具有廣泛的臨床應用價值，血清游離DNA檢測有助于早期發現復發轉移的高危人群。此外，血清游離DNA具有可動態觀測的優勢，因而在惡性腫瘤的治療過程中檢測血清游離DNA的變化趨勢，有助于在判斷臨床療效及指導治療方案的及時調整。

在本研究中發現，非小細胞肺癌患者血清中DNA濃度比健康對照者明顯升高(P＜0.01)，提示檢測血漿游離DNA水平可作為肺癌早期篩選的重要指標之一，國外有關血清游離DNA與腫瘤的研究中也有類似的結論［12］。進一步分析發現，血清游離DNA和肺癌患者的腫瘤大小、臨床分期有密切的關系，腫瘤直徑＞3 cm或分期較晚的患者血漿游離DNA水平明顯升高，統計學差異具有顯著性(P＜0.01)，尤其對于肺癌術后及化療有效的患者而言，血清游離DNA的水平明顯下降(P＜0.01)，提示血清游離DNA的水平可間接反映肺癌患者體內的腫瘤負荷，同時可作為療效評估的重要指標，國內學者溫開鎮等亦有類似的報道［13］。對肺癌患者不同病理類型血清游離DNA水平進行分析發現，腺癌患者和鱗癌患者之間血清游離DNA水平無明顯差異，該結果與國內學者鄧水秋的研究結果不一致［14］，其研究認為肺癌患者中腺癌患者血清游離DNA水平明顯高于鱗癌患者，不一致的原因可能與本研究樣本例數較小或未能采取隨機的原則選擇病例有關，故仍需進一步深入的探討。

總之，血清游離DNA定量分析取材方便，對患者造成的痛苦較小，而且易于被患者接受，檢測血清中游離DNA水平可間接反映肺癌患者體內的腫瘤負荷，而且在肺癌早期診斷及臨床療效的評價中具有一定的應用價值，值得進一步推廣應用。

表3 血漿游離DNA水平在肺癌治療前后的變化(ng/ml)Table 3 Changes of plasma DNA Level before and after treatment in patients with lung cancer (ng/ml)

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