重組分泌型人類免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核細胞中的表達及活性檢測＊

韋紅玉，曾怡，唐華英，趙麗娟（右江民族醫學院微生物學與免疫學教研室，廣西百色 533000）

人類免疫缺陷病毒1型（HIV－1）感染細胞可釋放大量的可溶性蛋白，其中包括Tat蛋白。Tat蛋白是HIV－1病毒復制所必需的反式激活因子，但Tat蛋白沒有分泌信號，只是當T細胞急性感染HIV－1時，Tat蛋白可被釋放到細胞外間質，并可作用于其他細胞或細胞內感染的其他病毒，發揮細胞轉化或激活病毒復制周期的作用。已有研究證實Tat蛋白與HIV－1 RNA 5′端啟動子上的反式激活反應元件（TAR）結合，激活HIV－1長末端重復序列（LTR）使其下游的基因得以表達，從而促進整個HIV－1轉錄本的表達［1］。研究表明Tat蛋白可激活人類皰疹病毒6型、8型，也可促進血管內皮細胞和艾滋病（AIDS）相關的卡波濟肉瘤（KS）細胞的生長、浸潤、分化及黏附等。

為研究細胞外Tat蛋白對其他病毒復制周期的影響，本研究在構建了重組HIV－1tat基因的分泌型真核表達載體的基礎上，對Tat蛋白的表達及生物活性進行了檢測，為進一步研究Tat蛋白的生物學作用，探索細胞外Tat蛋白對正常細胞或其他細胞內潛伏感染病毒的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、細胞 pcDNA3.1（＋）／Tat質粒在tat基因末端加入Linker序列GGAGGC，并融合Flag序列GACTACAAGGACGACGATGACAAG，以便利用抗Flag標簽抗體檢測Tat蛋白的表達。BCBL－1細胞為人類皰疹病毒8型感染、EB病毒陰性的體腔滲出性淋巴瘤細胞系，用含10%小牛血清的1640培養基，于5%CO2、37℃培養。人胚腎上皮細胞293細胞用含10%小牛血清的DMEM 培養基，于5%CO2、37℃培養。pcDNA3.1（＋）／Tat質粒、LTR－CAT 質粒、BCBL－1細胞由南京醫科大學盧春教授饋贈。293細胞為本實驗室保存。分泌型真核表達載體pSecTag2B 購自美國Invitrogen 公司。

1.1.2 試劑與儀器參考文獻［2］設計聚合酶鏈反應（PCR）引物，并在PCR 上游引物的5′端引入HindⅢ酶切位點，下游引物的5′端引入BamHⅠ酶切位點，為增強其表達，在上游引物5′端起始密碼子ATG 前添加了KOZAK 序列（GCCACC）以增強基因的表達，同時為便于Tat蛋白的檢測，原質粒中tat基因下游融合的Flag序列一并擴增。上游引物序列（方框內為KOZAK 序列，劃線部分為HindⅢ酶切位點）P15′－taa tgccat gag ttc cac ac－3′，下游引物序列（劃線部分為BamHⅠ酶切位點）gca g－3′；預期片段大小為807bp。同時設計另一對引物，上游引物5′端引入BamHⅠ酶切位點，P35′－taacac cat gag ttc cac ac－3′，下游引物5′端引入HindⅢ酶切位點，P45′－gga caa gct tga tga aca gta gca gca g－3′，此對引物擴增獲得的反向序列同時構建重組分泌型載體，作為重組對照質粒。PCR 引物均由上海英駿生物工程公司合成。Lammda DNA EcoRⅠ＋HindⅢ分子量標記、100bp ladder plus DNA 分子量標記、PCR 所用試劑Taq DNA 多聚酶及緩沖液、dNTP、限制性內切酶、T4DNA 連接酶、小牛堿性磷酸酶購自Fermentas公司，感受態DH5α購自北京天根生化科技公司，質粒提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒購自美國Omega 公司。Western blot所用試劑anti－Flag、anti－βactin、HRP－羊抗兔抗體、ECL發光試劑購自碧云天生物技術研究所。其他試劑均購自Amresco。研究中主要使用下列儀器：1－15PK 冷凍離心機（德國Sigma）、Mycycler PCR 儀（美國Bio－Rad）、垂直電泳轉印系統（美國Bio－Rad）、Chemidoc XRS型凝膠成像系統（美國Bio－Rad）。

1.2 方法

1.2.1 HIV－1tat基因的擴增及純化取pcDNA3.1（＋）／Tat質粒做模板，用PCR 引物擴增HIV－1tat基因，PCR 反應體系包括：上游引物10pmol；下游引物10pmol；10×Taq DNA 聚合酶緩沖液5μL；MgCl 2.5mmol／L；dNTPs每種2.5 mmol／L；Taq DNA 聚合酶2單位；總反應體積50μL。擴增條件：預變性94℃5 min；按94℃1 min，59℃30s，72℃1min，30個循環；72℃延伸5min。取5μL PCR 反應產物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察確認擴增成功。平衡酚：氯仿法純化剩余的PCR 反應產物。

1.2.2 tat基因重組分泌型真核表達載體的構建及tat基因插入方向的鑒定分別取1μg PCR 產物和1μg pSecTag2B，經HindⅢ酶切，10g／L瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收DNA 片段。T4DNA 連接酶16℃連接過夜后，轉化感受態DH5α，涂布含100μg／mL氨芐西林（Ampicillin，Amp）的LB平板，37℃培養16～18h。挑取5個生長的細菌克隆至含100μg／mL Amp的LB液體培養基，37℃250r／min 振蕩培養16～18h。提取質粒，HindⅢ與BamHⅠ酶切初步鑒定。經HindⅢ與BamHⅠ酶切初步鑒定為陽性的質粒，送上海生工公司進行序列測定。確定tat基因正向插入克隆（命名為pSecTat）和tat基因反向插入克隆（命名為pSecTat－AS）。

1.2.3 Western blot檢測tat基因重組質粒在293細胞中的表達及其分泌表達采用Invitrogen 公司生產的Lipofectamine 2000轉染試劑，按使用說明書進行轉染試驗。將pSecTat轉染至293細胞中，培養于六孔板，于轉染后24、48h收集293細胞，Western blot檢測真核細胞內Tat蛋白表達；用1×SDS凝膠上樣緩沖液裂解細胞，煮沸變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），并轉移PVDF 膜。分別以anti－Flag、anti－βactin 為一抗、HRP－羊抗兔抗體為二抗，Western blot檢測Tat蛋白細胞內表達情況，用增強的化學發光試劑ECL檢測，最后用柯達X 線片感光。

1.2.4 CAT－酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞內表達的重組Tat蛋白的調控活性將pSecTat與LTR－CAT 質粒（質粒中氯霉素乙酰轉移酶CAT 由HIV LTR 啟動，LTR 激活則CAT 表達）共轉染293細胞和BCBL－1細胞，轉染后24h，收集細胞，按CAT－ELISA 試劑盒說明書檢測CAT 表達水平；從而檢測細胞內表達的Tat蛋白的調控活性，同時以Tat基因反向重組質粒作為陰性對照。

1.2.5 CAT－ELISA 檢測表達分泌至細胞外表達的重組Tat蛋白的調控活性將pSecTat轉染至293細胞，培養于Transwell培養系統上層，將LTR－CAT 質粒轉染BCBL－1細胞，培養于Transwell培養系統下層，采用Transwell培養系統檢測pSecTat轉染至293細胞后分泌Tat蛋白及其胞外調控活性，分別于轉染后6、24、48、72h收集BCBL－1細胞；另采用同樣方法檢測pSecTat在腎系膜細胞中的分泌表達及其對BCBL－1細胞內LTR－CAT 的調控活性。收集的細胞按CAT－ELISA試劑盒說明書檢測CAT 表達水平；同時以Tat基因反向重組質粒作為陰性對照。

2 結果

2.1 HIV－1tat基因的擴增用引入限制性酶切位點的PCR引物，經PCR 擴增并用10g／L 瓊脂糖凝膠電泳后，在300bp附近出現條帶，與預期的324bp大小相符。見圖1。

2.2 tat重組分泌型真核表達載體的鑒定挑取正向和反向陽性克隆各2個提取的質粒用限制性內切酶HindⅢ與BanHⅠ酶切，并用10g／L瓊脂糖凝膠電泳后，共有2個正向克隆和1個反向克隆在約330bp和約5200bp位置出現條帶，其中1個反向克隆未見目的條帶，見圖2。將2個正向克隆質粒和1個反向克隆質粒送上海生工公司測序，結果顯示克隆的tat基因序列與GenBank中登記的HIV－1tat基因100%同源。

圖1 PCR 擴增HIV－1tat基因

圖2 tat重組分泌型真核表達載體的酶切鑒定

2.3 Western blot檢測tat基因重組質粒在293細胞中的表達 Western blot結果顯示，pSecTat在能在293細胞中表達，用anti－Flag抗體可檢測到約20×103的條帶，與預期的Tat蛋白的19×103分子量大小一致，而反向插入tat基因的對照質粒pSecTat－antise轉染293細胞則檢測不到該條帶（圖3）。

圖3 重組Tat蛋白的Western blot檢測

2.4 CAT－ELISA 檢測重組Tat蛋白在293細胞中的活性pSecTat與LTR－CAT 質粒共轉染293細胞后24、48h，CATELISA 檢測293細胞內CAT 的表達水平（圖4）。結果顯示，與pSecTat－AS對照質粒相比，pSecTat可刺激CAT 表達（P＜0.05），并隨轉染時間增加，CAT 表達增加。

圖4 CAT－ELISA 檢測重組Tat蛋白在293細胞中的活性

2.5 重組Tat蛋白在293細胞、BCBL－1細胞中的活性比較pSecTat與LTR－CAT 質粒共轉染293細胞、BCBL－1細胞后48h，CAT－ELISA 檢測293細胞、BCBL－1細胞內CAT 的表達水平（圖5）。結果顯示，與pSecTat－AS對照質粒相比，pSecTat在293細胞及BCBL－1細胞中均可表達，但在293細胞中的表達效率高于在BCBL－1細胞中的表達（P＜0.05）。

圖5 重組Tat蛋白在293細胞、BCBL－1細胞中的活性比較

2.6 重組分泌型Tat蛋白的細胞外活性檢測采用Transwell培養系統共培養轉染pSecTat的293細胞與轉染LTRCAT 的BCBL－1細胞，通過檢測BCBL－1細胞中CAT 表達水平，判斷pSecTat在293細胞中表達后分泌至細胞外的Tat蛋白的活性能否刺激BCBL－1細胞內CAT 表達。結果顯示，與pSecTat－AS對照相比，pSecTat轉染的293細胞可使BCBL－1細胞中CAT 蛋白表達顯著。但轉染時間延長至72h時，分泌型Tat已無活性（圖6）。

圖6 CAT－ELISA 檢測重組分泌型Tat蛋白的細胞外調控活性

3 討論

HIV－1反式轉錄激活因子（Tat）是HIV－1長末端重復序列（LTR）轉錄起始和病毒增殖所必需的調節蛋白，含86～101個氨基酸［3－4］。除了在病毒基因表達中的轉錄激活作用之外，Tat蛋白還可從HIV－1感染的完整細胞內釋放至細胞外，并保持活性。在HIV－1感染者血清中或體外培養細胞上清液中的Tat蛋白濃度可達40ng／mL［5－6］。這種外源的Tat蛋白可進入HIV－1未感染細胞誘導細胞凋亡，或進入潛伏感染細胞激活病毒基因組轉錄。Tat蛋白在HIV－1的致病機制中不僅是HIV－1復制所必需的蛋白，還發揮了細胞外毒素的作用。

本研究采用PCR 從pcDNA3.1（＋）／Tat質粒中擴增融合Flag標簽的tat全基因，利用HindⅢ與BamHⅠ雙酶切后，將其正向克隆入分泌型真核表達載體pSecTag2B 中，同時構建反向克隆作為對照。進行基因測序確定基因的序列和克隆方向后，進一步利用抗Flag抗體，通過Western blot檢測到Tat－Flag融合蛋白在293細胞內的表達。本研究還通過pSecTat與LTR－CAT 共轉染293細胞、pSecTat與LTR－CAT 分別轉染Transwell培養系統中上下層的細胞，進一步確認表達的Tat－Flag融合蛋白不但在293細胞內具有轉錄激活活性，還可分泌至細胞外，并進入BCBL－1細胞內，激活細胞內轉的LTR－CAT 報告質粒表達CAT。結果表明，本研究成功構建了tat基因重組分泌型真核表達載體，該載體不僅可在細胞內表達有轉錄激活活性的Tat－Flag蛋白，該融合蛋白還可分泌至細胞外，通過旁分泌作用，發揮其生物學活性。

在美國，有超過20%的AIDS患者同時患有KS，這類KS稱為AIDS－KS。多項研究表明，卡波濟肉瘤相關皰疹病毒（KSHV）的感染與KS的發生密切相關，而HIV－1感染者更容易發生KS。本課題組先前的研究證實，細胞內表達的Tat蛋白可激活潛伏的KSHV 的復制周期，并促進Kaposin蛋白介導的類KS腫瘤形成［7－8］。本研究在檢測重組Tat蛋白的分泌活性時，檢測了293細胞分泌的Tat蛋白對KSHV 感染細胞BCBL－1細胞內LTR－CAT 質粒的調控，結果證實分泌型的Tat蛋白可以進入BCBL－1細胞，并誘導LTR－CAT 質粒中的CAT 表達。表明分泌型Tat蛋白具有穿入BCBL－1細胞的能力，并具有轉錄激活活性。本研究使用的BCBL－1細胞是KSHV 潛伏感染細胞系，構建重組tat基因分泌型載體對研究Tat蛋白在AIDS－KS發生機制中的作用有重要意義。

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