應用豬圓環病毒2型缺失NLS的Cap蛋白建立一種ELISA檢測方法

張春雷，陳春麗，王 強，葉 昱，張 杰，謝康尚，靳立明，廖 明，樊惠英

（1.華南農業大學農業部獸用疫苗創制重點實驗室，獸醫學院，廣東 廣州 510642；2.廣東大華農動物保健品股份有限公司，廣東 新興 527400；3.廣東華農溫氏畜牧股份有限公司，廣東 新興 527400）

豬圓環病毒2型（PCV2）為單股環狀負鏈DNA病毒，屬于圓環病毒科圓環病毒屬。PCV2與豬的多種疾病綜合征密切相關，包括豬斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸系統疾病綜合征（PRDC）、母豬的繁殖障礙及仔豬先天性震顫等疾病[1-2]，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。

PCV2基因組全長1 767 bp或1 768 bp，共編碼11個開放閱讀框（Open reading frames，ORFs），其中ORF1和ORF2是兩個最大的開放閱讀框，分別編碼病毒DNA滾環復制相關的蛋白（Rep）和病毒核衣殼蛋白（Cap）[3]。Cap蛋白是病毒的主要結構蛋白，也是主要的免疫原性蛋白[4]。多肽掃描顯示，PCV1與PCV2的Cap蛋白上具有共同的抗原決定簇，但血清學試驗顯示，兩種血清型的Cap蛋白沒有抗原交叉反應，PCV2的Cap蛋白抗體（或抗原）不能與PCV1 Cap蛋白（或抗體）發生反應，這為建立特異檢測PCV2的血清學方法奠定了基礎。Cap蛋白在大腸桿菌中的表達已研究得較多，表達產物多以包涵體形式存在[5-6]，導致表達蛋白的活性不理想，限制了其進一步的應用。本試驗擬用原核表達的可溶性的SUMO-dCap融合蛋白包被ELISA板，建立檢測PCV2抗體的間接ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 重組質粒和主要試劑 表達PCV2缺失NLS的Cap蛋白的原核表達質粒（pCold-SUMO-dCap），由本課題組構建[7]，其宿主菌ArticExpress，購自哈爾濱海基生物公司；TMB顯色液，購自廣州艾鉑金斯公司；HRP標記的羊抗豬IgG（H+L），購自廣州美津生物公司；PCV2血清抗體ELISA檢測試劑盒，購自深圳綠詩源公司。

1.2 血清樣品 血清樣品采自廣東省規模化豬場，共267份，經深圳綠詩源商品化PCV2 ELISA試劑盒檢測，再通過間接免疫熒光鑒定，二者鑒定均為陽性的共176份；鑒定均為陰性的共75份；16份為可疑。

1.3 ELISA方法的建立以及條件的優化 采用方陣滴定法測定重組蛋白和待檢血清最佳工作濃度。將純化好的SUMO-dCap融合蛋白分別按60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375、0.4688 μg/mL倍比稀釋包被酶標板，陽性血清和陰性血清分別按1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640依次倍比稀釋組成方陣，按照間接ELISA程序操作，以陽性血清OD值達到并接近1.0，陰性血清OD值低于0.2，P/N（陽性/陰性）值較大的所在孔的抗原濃度和血清稀釋度作為最佳抗原工作濃度和血清稀釋度。然后對該ELISA方法的最適抗原包被條件、封閉時間、血清作用時間、酶標抗體稀釋倍數、酶標抗體反應時間、底物作用時間進行優化。

1.4 陽性和陰性臨界值的確定 隨機選取32份豬陰性血清（經PCV2血清抗體ELISA檢測試劑盒以及間接免疫熒光試驗檢測確定為陰性的豬血清），用本研究所建立的間接ELISA方法檢測，計算32份豬陰性血清的平均OD450nm值（X）和標準方差（SD），以大于X+3SD判為陽性，小于X+2SD判為陰性，介于兩者之間為可疑，建立判定標準。

1.5 SUMO蛋白對照試驗 純化后的SUMO標簽蛋白經過稀釋，使其濃度和SUMO-dCap蛋白的包被濃度相同，然后包被ELISA板，按照經優化的ELISA程序操作，測定8份陽性血清和8份陰性血清的OD450nm值，檢測SUMO標簽蛋白對所建立的ELISA方法的影響。

1.6 血清交叉反應試驗 用本研究建立的ELISA方法分別檢測豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬乙型腦炎病毒（PJEV）、豬口蹄疫病毒（FMBV）和豬瘟病毒（CSFV）陽性血清，同時設立PCV2抗體陰陽性血清對照和空白對照，確定血清交叉反應情況。

1.7 特異性、靈敏性和符合率試驗 用本研究所建立的ELISA方法與深圳綠詩源公司的PCV2抗體檢測試劑盒平行檢測267份豬血清，以深圳綠詩源公司ELISA檢測試劑盒作參照，測定本公司的ELISA方法的特異性和靈敏性，并統計兩種方法的符合率。

1.8 批內和批間重復性試驗 以重組蛋白包被ELISA板，分別取5份陰性和陽性血清進行檢測，每個血清樣品重復4孔，進行批內重復性試驗；再用不同時間制備的三批ELISA板，同時對6份PCV2陽性血清和2份PCV2陰性血清進行批間重復性試驗。

2 結果

2.1 ELISA方法工作條件的優化 以SUMO-dCap蛋白為ELISA抗原，抗原包被的最佳工作濃度為0.938 μg/mL，最佳工作條件為4℃包被過夜；以1%BSAPBST為封閉液，于37℃最佳封閉時間為1 h；待檢血清最佳稀釋倍數為160倍，于37℃最佳作用時間為30min；酶標抗體最佳稀釋倍數為10 000倍，于37℃最佳作用時間為30min；以TMB為底物顯色液，于室溫最佳顯示時間為10min。

2.2 陽性和陰性臨界值的確定 用本研究建立的間接ELISA方法檢測，32份豬陰性血清OD450nm最大值為0.257，最小值為0.094，平均OD450nm值(X)為0.155，標準方差(SD)為0.039。從而得出樣本的X+3*SD=0.272，樣本的X+2*SD=0.233，將樣本OD450nm≥0.272判為陽性，樣本OD450nm≤0.233判為陰性，介于二者之間判為可疑。

2.3 SUMO蛋白對照試驗 SUMO標簽蛋白包被ELISA板，測定8份豬陽性血清和8份豬陰性血清的OD450nm值，結果顯示，SUMO標簽蛋白包被的酶標板與豬陽性和陰性血清反應的OD450nm值均低于建立的ELISA方法的陰性臨界值（0.233）。說明SUMO標簽蛋白不干擾建立的ELISA方法的臨床應用。

2.4 血清交叉反應試驗 用建立的ELISA方法分別檢測PRRSV、PRV、PJEV、FMDV和CSFV陽性血清（血清已確定無PCV2陽性抗體），同時設立PCV2抗體陰陽性血清對照和空白對照，確定血清交叉反應情況。結果均為陰性，表明無血清學交叉反應。

2.5 特異性、靈敏性和符合率試驗 本ELISA方法與深圳綠詩源公司的ELISA血清抗體檢測試劑盒分別對267份豬血清進行平行檢測，以深圳綠詩源公司的ELISA檢測試劑盒作參照，測定本ELISA方法的特異性、靈敏性及符合率。結果見表1，本研究建立的ELISA方法的特異性為93.33%（70/75），靈敏性為97.16%（171/176），兩種方法的符合率為90.26%（241/267）。

表1 間接ELISA方法與試劑盒平行檢測比較

2.6 重復試驗 同一批次的ELISA板，檢測5份血清，各重復4孔，經統計學分析，其變異系數在1.25%～6.37%，說明本ELISA方法批內變異程度較小，具有可重復性。3個批次的ELISA板，檢測8份血清，經統計學分析，其變異系數在6.68%～13.58%，表明建立的ELISA方法的批間穩定性較好。

3 討論

目前，PCV2的檢測方法很多，其中PCR技術是進行病原檢測和定型的常用方法，但只適用于患病豬在病毒血癥時期或排毒時檢測，而血清學方法有利于大規模普查。Nawagitgul等[8]以細胞培養的PCV2和重組的PCV2 Cap蛋白建立了兩種ELISA方法，其中利用重組Cap蛋白作為ELISA包被抗原比用細胞培養的病毒作為抗原更為有效。Liu等[9]利用桿狀病毒表達系統在Sf-21昆蟲細胞中表達了PCV2 Cap蛋白，并以此Cap蛋白建立了間接ELISA方法，其特異性和靈敏性分別達到88.5%和89.4%。但是該方法的Cap蛋白的制備是通過包涵體復性而得到，操作繁瑣，且培養昆蟲細胞成本很高。目前國內市場上的PCV2抗體ELISA檢測試劑盒主要是以基因工程表達的Cap蛋白作為包被抗原，如武漢科前、深圳綠詩源、瑞普生物公司等公司的產品。但大多數Cap蛋白表達后是以包涵體形式存在，表達蛋白活性一般，進而會影響到試劑盒的檢測效果。所以，本研究以大腸桿菌中高效表達的PCV2可溶性SUMO-dCap融合蛋白作為包被抗原，建立一種PCV2抗體檢測ELISA方法。

本研究通過方陣滴定試驗確定抗原包被濃度和血清稀釋度，抗原的包被濃度對試驗的結果有很大影響。抗原濃度過高，會由于抗原蛋白分子之間的相互作用力較大而造成蛋白分子的多層化，影響試驗結果；另外，抗原濃度過高還容易造成血清中其他成分與抗原的非特異性結合，從而造成假陽性率升高。由于血清蛋白成分復雜，血清稀釋度的高低也會影響試驗的特異性和敏感性。在方陣滴定試驗中，血清稀釋倍數較低時，陰性血清和ELISA抗原的非特異性反應很高；隨著血清稀釋倍數的增高，陰性血清和ELISA抗原的非特異性反應降低，趨于穩定。試驗結果表明，當抗原包被濃度為0.938μg/mL、血清稀釋到160倍時，P/N值較大，陰、陽性血清與ELISA抗原的非特異性反應降低到不影響試驗結果的程度。另外，在該試驗的過程中，發現血清稀釋液特別關鍵。本試驗雖然沒有對血清稀釋液作系統的優化，但是在試驗過程中發現如果用PBST作血清稀釋液，陰陽性血清反應的OD450nm值均較高，而血清稀釋液改為封閉液后，陰性OD值明顯降低，P/N值顯著增大。

為了檢測SUMO標簽蛋白對建立的ELISA方法的影響，本研究以0.938μg/mL的SUMO蛋白包被ELISA板，通過不同的陽性血清和陰性血清與其反應。結果顯示，其OD450nm值均低于SUMO-dCap蛋白ELISA方法的陰性值，證明SUMO標簽蛋白對所建立的ELISA方法干擾作用不明顯，可以忽略，同時也進一步驗證了SUMO-dCap蛋白可用于建立PCV2血清抗體ELISA檢測方法。

本研究建立的ELISA方法與豬藍耳病病毒、豬偽狂犬病病毒、豬乙型腦炎病毒、豬口蹄疫病毒和豬瘟病毒陽性血清無血清學交叉反應，具有很強的特異性；以深圳綠詩源公司的ELISA檢測試劑盒為參照，本研究建立的ELISA方法的特異性為93.33%，靈敏性為97.16%，表明建立的ELISA可信度高；對于重復性試驗，批內和批間的變異系數分別為1.25%～6.37%和6.68%～13.58%，結果顯示，本ELISA方法批內重復性較好，但是批間的重復性還有待通過對蛋白穩定劑、包被板保存期、稀釋液等方面的研究進行優化。本方法的建立，為PCV2的診斷和流行病學調查提供有利的工具，也為研制檢測PCV2抗體的ELISA試劑盒奠定了基礎。

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