NADPH 氧化酶在氟誘導小膠質細胞氧化應激中的作用

胡玉華，顏 凌，劉子酉，席淑華

（1.廈門醫學高等專科學校，福建 廈門 361000；2.中國醫科大學公共衛生學院，遼寧 沈陽 110001）

地方性氟中毒是我國發病最廣、人口最多、病情最重的地方病之一，有病區縣1380 個，受威脅人口達1.25 億［1］。氟中毒除了引起氟斑牙和氟骨癥外，一些氟中毒患者常伴有神經系統癥狀，表現為頭痛、頭暈、記憶力減退等中樞神經系統功能障礙癥狀。氟離子可以通過血腦屏障在腦組織中蓄積［2］，氟的反應活性極強，可直接攻擊氧，干擾氧代謝，影響抗氧化酶的活性，導致活性氧（ROS）、自由基增多。活性氧與自由基已被認為是氟引起腦損傷的基礎。

小膠質細胞是腦組織中的免疫細胞，一些內外因素均可使其激活，活化后的小膠質細胞可通過NADPH 氧化酶（還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸）產生大量的ROS。NADPH氧化酶在小膠質細胞高表達，是催化生成超氧陰離子自由基（O2·-）的主要酶類。本研究以小鼠小膠質細胞（BV-2細胞）為受試對象，通過加入NADPH 氧化酶抑制劑后測定氟處理BV-2細胞ROS產生情況，了解NADPH 氧化酶在氟作用下小膠質細胞ROS產生中的作用，為氟致中樞神經系統損傷機制的研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超凈工作臺（江蘇蘇凈集團公司）；150 型二氧化碳（CO2）恒溫培養箱（荷蘭Heraeus公司）；倒置顯微鏡（Nikon公司）；流式細胞儀（FACScan）。氟化鈉（NaF，上海生工生物工程有限公司）；MTT（美國Hyclone公司）；NADPH 氧化酶抑制劑API（Santa Cruz Biotechnology 公司）；硝基酪氨酸（NT）試劑盒（北京安必維抗體技術有限公司）。

1.2 細胞培養

小鼠小膠質細胞（BV-2）由中國協和醫科大學基礎醫學細胞中心提供。細胞常規培養于DMEM 高糖培養基（含10%胎牛血清，1×105U／L 青、鏈霉素），5% CO237℃條件下培養。待細胞達到70%～80%融合時進行1：3傳代，本實驗細胞采用2d換液，3d傳代一次的方法。

1.3 細胞增殖活力的測定

用0.25%的胰蛋白酶消化單層培養細胞，用含10%的胎牛血清的培養液配成單個細胞懸液，將細胞以1×104個／孔的密度接種于96孔板中，每孔體積200μL。將96孔板放入CO2細胞培養箱中繼續培養2～3d后，加入濃度為0、1、5、10、25、50、100mg／L 的氟化鈉，分別在染毒6、12、48h，加入MTT 溶液，用酶標儀測定各孔吸光度，測定波長為490 nm。細胞活力用MTT 的還原率表示。

1.4 細胞內ROS檢測

將細胞以4×104個／mL 的密度接種于6 孔板，于5%CO2細胞培養箱中繼續培養2～3d后，加入濃度為0，1，5，10，25，50，100mg／L 的氟化鈉，染毒6，12h和24h后加入熒光探針（DCFH-DA），37℃孵育30min，用流式細胞儀對細胞內ROS含量進行檢測。對NADPH 氧化酶抑制劑處理的細胞，在細胞生長約60%時，加入100μm NADPH 氧化酶抑制劑API，2h之后加入濃度50mg／L NaF 處理24h，加入熒光探針（DCFH-DA），37℃孵育30min，用流式細胞儀對細胞內ROS 含量進行檢測。激發波長488nm，發射波長530nm，以DCF的平均熒光強度表示ROS生成量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0for Windows軟件進行數據統計分析。采用單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較，組間兩兩比較采用LSD 檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氟化鈉對BV-2細胞增殖活力的影響

BV-2細胞染毒6h后，100mg／L NaF 染毒組細胞增殖活力顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01），但在1和5mg／L NaF處理組，細胞增殖活力出現一個顯著升高現象，之后，隨染氟劑量的增加細胞增殖活力顯著降低；染毒12h后，10、100mg／L NaF染毒組細胞增殖活力顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；染毒24h后，1、5、10、100mg／L NaF染毒組細胞增殖活力顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 氟化鈉對BV-2細胞增殖活力的影響（±s，n=3）

表1 氟化鈉對BV-2細胞增殖活力的影響（±s，n=3）

注：＊與對照組相比，P＜0.05；＃ 與對照組相比，P＜0.01。

2.2 氟化鈉對BV-2細胞中ROS含量的影響

BV-2細胞染毒6h后，5mg／L NaF以上染毒組細胞內ROS含量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；染毒12h后，10mg／L NaF以上染毒組細胞內ROS含量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；染毒24h后，50、100mg／L NaF染毒組細胞內ROS含量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 氟化鈉對BV-2細胞內ROS含量的影響（±s，n=3）

表2 氟化鈉對BV-2細胞內ROS含量的影響（±s，n=3）

注：＊與對照組比較，P＜0.05，＃ 與對照組比較，P＜0.01。

2.3 NADPH 氧化酶對氟化鈉暴露的BV-2細胞ROS水平的影響

我們先前的研究已發現氟能引起小膠質細胞ROS水平增加［3］，因此，為檢測氟引起的ROS水平增高是否由NADPH 氧化酶引起，我們加入NADPH 氧化酶抑制劑API與氟共同處理小膠質細胞，發現API能夠顯著降低NaF 誘導的BV-2細胞內ROS含量，見表3。

表3 NADPH 氧化酶抑制劑對氟處理的BV-2細胞ROS含量的影響（±s，n=3）

表3 NADPH 氧化酶抑制劑對氟處理的BV-2細胞ROS含量的影響（±s，n=3）

注：a 與0mg／L NaF染毒組比較，P＜0.01；b 與50mg／L NaF染毒組比較，P＜0.01。API：NADPH 氧化酶抑制劑。

3 討論

由于神經系統耗氧率高，腦膜富含易氧化的多不飽和脂肪酸，腦組織中的抗氧化酶活性相對比其他組織低，對氧介導的損傷非常敏感。目前多數研究認為，氟誘導的氧化應激是氟引起腦損傷的基礎。作為神經系統的免疫細胞，小膠質細胞在正常狀態下處于靜息狀態，當中樞神經微環境發生改變時可激活為活化狀態［4］，抵御外來抗原的侵襲，對機體產生保護作用。然而，過度的活化可釋放過多的炎性因子和ROS等，引起中樞神經系統損傷［5，6］。NADPH 氧化酶是介導免疫細胞細胞外超氧化物產生的主要酶，在小膠質細胞中高表達。NADPH 氧化酶能夠催化氧分子生成超氧陰離子自由基（O2·-）［7］。本研究發現，氟處理組細胞內ROS的含量顯著高于對照組，并呈顯著的劑量-反應關系。由此可以推測，氟可誘導ROS水平增高，引起氧化應激。API，一種廣泛使用的NADPH 氧化酶抑制劑，顯著降低了氟引起的小膠質細胞內ROS含量。說明NADPH 氧化酶參與了氟誘導的小膠質細胞氧化應激反應。本研究結果表明氟可降低小膠質細胞活力，引起小膠質細胞氧化損傷，NADPH 氧化酶在氟誘導的ROS產生中起一定作用。

［1］孫殿軍.論中國地方病控制之前景［J］.中國地方病學雜志，2009，128（1）：3-6

［2］Vani ML，Reddy KP.Effects of fluoride accumulation on some enzymes of brain and gastrocnemium musule of mice［J］.Fluoride，2000，33（1）：17-26

［3］劉子酉，潘峙宇，王惠惠，等.氟致小鼠小膠質細胞的活化及氧化損傷的研究［J］.環境與健康雜志，2010，27（8）：679-681

［4］TaKao T，Traccy DE，Mitchell WM，et al.Interleukin-1receptors in mouse brain［J］.Characterization and Neuronallocalization Endocrinology，1990，127：3070

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［6］Chew LJ，Takanohashi A，Bell M.Microglia and inflammation：Impact on developmental brain injuries［J］.Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews，2006，12（2）：105-112

［7］Gao HM，Liu B，Zhang WQ，et al.Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson＇s disease［J］.FASEB J，2003，17（13）：1954-1956