兔、豚鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立

卞 勇，鞠曉云，范乃兵

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥嚴(yán)重危害人類健康。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多種因素長期共同作用的結(jié)果。探明動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)理、篩選研究有效治療藥物是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，而建立一種與人類動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)相一致或接近的整體動(dòng)物模型則是進(jìn)行上述研究的關(guān)鍵。近年來，國內(nèi)外學(xué)者使用鳥類、鼠類、兔、豬、非人靈長類動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等用于實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化的研究，在取得諸多進(jìn)展的同時(shí)，也逐步發(fā)現(xiàn)模型的缺陷和不足，限制了其應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

兔，體重2.5～3.0kg，雄性，金陵種兔場(chǎng)，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0003。豚鼠，體重280～310g，雄性，南京江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0008。

1.2 藥物及試劑

總膽固醇試劑盒：南京建成生物研究所，批號(hào)：20130917。甘油三酯試劑盒：南京建成生物研究所，批號(hào)：20130822。高密度脂蛋白試劑盒：南京建成生物研究所，批號(hào)：20131024。低密度脂蛋白試劑盒：南京建成生物研究所，批號(hào)：20130915。一氧化氮試劑盒：南京建成生物研究所，批號(hào)：20130825。腫瘤壞死因子ELISA 試劑盒：南京建成生物研究所，批號(hào)：20130711。高脂飼料：1%膽固醇，0.3%膽酸鈉，10%豬油，88.7%普通飼料。

1.3 試驗(yàn)儀器

Thermo Multiskan Go酶標(biāo)儀；日立7100型全自動(dòng)生化分析儀（751-0082）。

2 實(shí)驗(yàn)方法［1～6］

將豚鼠和兔子分別隨機(jī)分為：正常對(duì)照組（飼普通飼料）、模型組（1%膽固醇，0.3%膽酸鈉，10%豬油，88.7%普通飼料），每組10只，連續(xù)飼養(yǎng)8周。在第4、8周，豚鼠眼眶取血，兔耳緣靜脈取血，備用。于末次飼養(yǎng)后禁食不禁水8h，用3%戊巴比妥鈉麻醉后將動(dòng)物固定于手術(shù)臺(tái)，頸總動(dòng)脈取血，備用。分離主動(dòng)脈，10%中性福爾馬林固定，做組織病理學(xué)檢測(cè)。

3 檢測(cè)指標(biāo)

3.1 血脂檢測(cè)

血液3000r／min，離心10min，吸取上層血清，用日立7100型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中血清TG、TC、HDL、LDL含量。

3.2 血清NO、TNF-α含量檢測(cè)

血液3000r／min，離心10min，吸取上層血清，按試劑說明檢測(cè)NO、TNF-α含量。

3.3 主動(dòng)脈組織病理學(xué)檢測(cè)

取主動(dòng)脈，10%福爾馬林固定。石蠟包埋切片，切片厚約4～5μm，HE染色。由病理專業(yè)研究人員閱片，光鏡下觀察動(dòng)脈壁（內(nèi)膜、中膜）的組織學(xué)變化。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5.1 對(duì)血脂的影響

高脂飼料喂養(yǎng)4 周后，兔模型組TC、TG、LDL 明顯升高，與正常組比較有顯著性差異，而HDL 降低，與兔模型組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。豚鼠模型組血脂指標(biāo)有所改變，但與豚鼠模型組比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。高脂飼料喂養(yǎng)8周后，兔模型組TC、TG、LDL 明顯升高，與兔正常組比較有顯著性差異，而HDL 降低，與兔模型組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。豚鼠模型組TC、TG、LDL、HDL 升高，與豚鼠模型組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。見表2。

表1 高脂喂養(yǎng)4周后對(duì)血清TC、TG、HDL、LDL的影響（±s，n=10）

表1 高脂喂養(yǎng)4周后對(duì)血清TC、TG、HDL、LDL的影響（±s，n=10）

注：模型組與正常組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

表2 高脂喂養(yǎng)8周后對(duì)血清TC、TG、HDL、LDL的影響（±s，n=10）

表2 高脂喂養(yǎng)8周后對(duì)血清TC、TG、HDL、LDL的影響（±s，n=10）

注：模型組與正常組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

5.2 對(duì)血清NO、TNF-α含量的影響

高脂飼料喂養(yǎng)8 周后，兔模型組NO、TNF-α明顯升高，與兔正常組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。豚鼠型組NO、TNF-α明顯升高，與豚鼠正常組比較有顯著性差異（P＜0.05）。見表3。

表3 對(duì)血清NO、TNF-α含量的影響（±s，n=10）

表3 對(duì)血清NO、TNF-α含量的影響（±s，n=10）

注：模型組與正常組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

5.3 主動(dòng)脈組織病理學(xué)檢測(cè)

（1）兔正常對(duì)照組：10／10只動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞完整，排列整齊，內(nèi)彈力膜清晰完好，中膜平滑肌細(xì)胞體積、排列正常，內(nèi)膜及中膜均未見泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積。見圖1。

（2）兔模型組：8／10只動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚（++），纖維隆起明顯（++），內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞（++），內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性、部分缺失，內(nèi)彈力膜斷裂、模糊（++），中膜增厚伴平滑肌細(xì)胞增生（++），胞體變大，排列紊亂，內(nèi)膜及中膜均可見巨噬細(xì)胞。見圖2。

（3）豚鼠正常對(duì)照組：10／10 只各動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞完整，排列整齊，內(nèi)彈力膜清晰完好，中膜平滑肌細(xì)胞體積、排列正常，內(nèi)膜及中膜均未見泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積。見圖3。

（4）豚鼠模型組：7／10只動(dòng)脈內(nèi)膜輕度增厚（+），纖維輕度隆起（+），內(nèi)含少量泡沫細(xì)胞（+），內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性、部分缺失，內(nèi)彈力膜斷裂、模糊（+），中膜增厚伴平滑肌細(xì)胞增生，胞體變大，排列紊亂，內(nèi)膜及中膜均可見巨噬細(xì)胞。見圖4。

圖1 兔正常組×200

圖2 兔模型組×200

圖3 豚鼠正常組×200

圖4 豚鼠模型組×200

6 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈硬化中最重要的一個(gè)類型，基本損害是動(dòng)脈內(nèi)膜局部呈斑塊狀增厚，故又稱動(dòng)脈粥樣硬化斑塊或簡稱斑塊，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率很高，且累及全身動(dòng)脈血管，主要累及主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈、腎動(dòng)脈、大、中型肌彈力型動(dòng)脈，最終導(dǎo)致他們的管腔狹窄以致完全堵塞，使這些重要器官缺血缺氧、功能障礙以致機(jī)體死亡。動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心臟疾病和中風(fēng)的首要原因。

高脂血癥與AS的關(guān)系已經(jīng)得到證實(shí)，AS的嚴(yán)重程度隨血漿膽固醇水平的升高而加重。LDL 是血漿膽固醇的主要存在形式，能在血漿內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)膜下經(jīng)自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化而轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸揎椀腖DL（低密度脂蛋白o(hù)x-LDL）。生理狀態(tài)下，HDL促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)錄，抗炎抗氧化，抗血栓并促纖溶，具有抗AS 作用。所以血脂水平特別是LDL的升高和HDL的降低與AS發(fā)病率呈正相關(guān)。但最新的研究表明，在某些病理狀態(tài)下，HDL 抗動(dòng)脈粥樣硬化作用受損，可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。所以血脂水平的檢測(cè)是評(píng)價(jià)AS病變的一個(gè)公認(rèn)的、必不可少的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)在造模方式上采用高脂飼料喂養(yǎng)方式，對(duì)動(dòng)物損傷小，形成病變與人類由膳食結(jié)構(gòu)改變形成的動(dòng)脈粥樣硬化類似。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物整體狀況良好，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物隨時(shí)間推移而漸見疾病癥狀出現(xiàn)，其血脂水平明顯增高。兔模型組血粘度、血漿粘度升高，TC、TG、LDL、NO、TNF-α升高，HDL降低，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。豚鼠TC、TG、LDL、HDL、NO、TNF-α升高，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。兩種動(dòng)物模型組組動(dòng)脈病理檢測(cè)均不同程度出現(xiàn)動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，纖維隆起明顯，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性、部分缺失，內(nèi)彈力膜斷裂、模糊，中膜增厚伴平滑肌細(xì)胞增生，胞體變大，排列紊亂，內(nèi)膜及中膜均可見巨噬細(xì)胞。兔動(dòng)脈粥樣硬化誘導(dǎo)時(shí)間比豚鼠短，成模率比豚鼠高，病變更顯著。

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