糖尿病腎病大鼠血漿差異表達蛋白的質譜分析

魏 敏，羅 仁，李璟怡，柳志偉，鄭雪花

(1福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，福州 350122;2南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院;*通訊作者，E-mail:minwei99@163.com)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，也是重要的死亡原因。近年來，DN已經成為導致終末期腎病(ESRD)的主要病因［1］，糖尿病腎病嚴重威脅人類健康。早期診斷、早期治療對糖尿病腎病預后有重要的影響，因此尋找靈敏度特異度高的分子標志物，以達到早期診斷的目的具有重要的意義。蛋白組學技術的發(fā)展適用于尋找疾病的分子標記物研究［2，3］。本研究以糖尿病腎病(DN)大鼠模型為研究對象，應用雙向電泳和質譜分析技術，初步篩選糖尿病腎病的差異表達蛋白質，為糖尿病腎病的發(fā)生機制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用SPF級Wistar雄性大鼠16只，體重200－280 g，鼠齡為3個月左右，南方醫(yī)科大學動物實驗中心供應，合格證:SCXK(粵)2011－0015。

1.1.2 主要儀器設備 等電聚焦儀(Protean IEF cell)、垂直電泳儀(ProteanⅡxi cell)及其配件均為Bio-Rad公司配套儀器;圖像分析軟件為PD-Quest;質譜儀用德國布魯克(Bruker Dalton)Autoflex speed MALDI－TOF/TOF質譜儀。

1.1.3 試劑 干膠條 drystrip(24 cm，pH 4－7)購自Bio-Rad公司;IPG Buffer(pH 4－7)、水化盤、覆蓋油購自GE公司;尿素、二硫蘇糖醇(DTT)、3－［(3－膽酰胺丙基)－二乙銨］－丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羧基氨基甲烷(Tris堿)、丙烯酰胺(Arc)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、過硫酸銨(AP)、碘代乙酰胺(IAA)均為Sigma公司產品;硫脲為Fluka公司產品;硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、甲醛、硝酸銀、乙醇、冰醋酸、醋酸鈉、甘氨酸均為天津大茂化學試劑廠試劑，分析純。所有緩沖液均用Milli-Q水配制。藥物STA、血漿去高豐度蛋白試劑盒(ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，造模大鼠8只按65 mg/kg腹腔內一次性注射STZ。STZ臨用前用枸櫞酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH 4.5)配制，10 min內注射完，同時其余8只大鼠設為正常對照組。

1.2.2 血漿采集 處死DN模型組和正常對照組大鼠時腹主動脈取血，置 4℃ 3 000×g離心10 min，吸取上層血漿，EP管每100μl分裝后，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙向電泳 取100μg蛋白樣品與上樣緩沖液(4%CHAPS，65 mmol/L DTT，1%IPG buffer，7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，1×BPB溴酚藍)充分混合，總體積460μl，選用24 cm pH 4－7干膠條drystrip，參考文獻［4］和儀器操作手冊進行等電聚焦、SDS-PAGE凝膠電泳。

1.2.4 凝膠染色 電泳結束后，用塑料尺子將玻璃板翹起，輕輕取下膠條，并切角標記，放入染色盤中進行硝酸銀染色。

1.2.5 圖像掃描與分析 掃描儀獲取染色后凝膠圖像，用PD-Quest軟件進行分析，選取表達量相差2倍以上為差異表達范圍。

1.2.6 質譜鑒定及數(shù)據(jù)庫檢索 對選定的差異蛋白點進行膠內酶切及質譜鑒定。采用德國布魯克(Bruker Dalton)Autoflex speedTMMALDI－TOF/TOF質譜分析，最優(yōu)質量分辨率為1 500 Da，掃描質量范圍為700－3 200 Da，收集信號，胰酶自切峰為內標校正質譜儀。質譜數(shù)據(jù)采用flexAnalysis(BrukerDalton)軟件過濾基線峰、識別信號峰。利用BioTools(Bruker Dalton)軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關蛋白質，同時查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質為何種蛋白質。

2 結果

2.1 銀染2-DE圖譜及差異分析

正常對照組、模型組銀染2-DE圖譜見圖1。將正常對照組、模型組凝膠圖像用PD-Quest軟件進行差異分析。與正常對照組相比，模型組血漿蛋白質銀染雙向凝膠電泳圖譜中高表達的蛋白質斑點54個，低表達的蛋白質斑點19個。

2.2 質譜鑒定

結合軟件分析及手工篩選，對2-DE獲得的差異表達蛋白點選定16個挖點進行膠內酶切，再用MALDI-TOF/TOF質譜鑒定分析，經BioTools軟件分析蛋白數(shù)據(jù)庫NCBInr檢索，成功鑒定出8種蛋白質(見表1)。血清對氧磷酶肽指紋圖譜見圖2、C反應蛋白肽指紋圖譜見圖3，橫坐標表示肽段的質荷比，縱坐標表示肽段強度。

3 討論

圖1 銀染雙向電泳圖譜Figure 1 Silver stained 2-DE map of proteins in normal control group and model group

表1 質譜鑒定的差異表達蛋白Table 1 Differentially expressed proteins identified by mass spectrometry

圖2 血清對氧磷酶肽指紋圖譜Figure 2 Peptide mass fingerprinting of serum paraoxonase

圖3 C反應蛋白肽指紋圖譜Figure 3 Peptide mass fingerprinting of C-reactive protein

糖尿病腎病的發(fā)病機制十分復雜，有多種因素共同作用［5］，包括腎臟血流動力學的改變、血糖過高導致代謝紊亂、高血壓及血管活性物質代謝異常、細胞因子的作用、遺傳及不良生活習慣的影響等。糖尿病腎病目前還很難做到早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷，因此，找到與DN相關的特異性分子標志物已成為糖尿病腎病研究的熱點問題之一。

蛋白組學由澳大利亞科學家Witzmann等［6］于1995年首次提出，是整合蛋白質提取、分離、質譜分析和生物信息學等技術，對組織和細胞中的蛋白質表達水平及功能進行高通量篩選和分析的一門學科。蛋白質組學技術在DN的發(fā)病機制研究中起著重要的作用，蛋白分離后的質譜技術主要用于蛋白質的鑒定。其基本原理是將樣品分子或離子化后，根據(jù)離子間質量與電荷比(m/z)的差異來分離并確定分子量。本項目研究應用雙向凝膠電泳技術成功分離蛋白，找出差異蛋白點，然后應用質譜技術MALDI－TOF/TOF對差異蛋白點進行鑒定。最終初步鑒定8種蛋白質可能與糖尿病腎病相關，分別是血清對氧磷酶(serum paraoxonase)、C反應蛋白(C-reactive protein)、甲狀腺素運載蛋白(transthyretin)、Igκ鏈C區(qū)(Ig kappa chain C region)、纖維蛋白原α鏈(fibrinogen alpha chain)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor)、纖維蛋白原γ鏈(fibrinogen gamma chain)、結合珠蛋白(haptoglobin)。

血清對氧磷酶、C反應蛋白可能與糖尿病腎病的發(fā)病機制密切相關，有研究［7］表明血清對氧磷酶(serum paraoxonase，PON)是存在于高密度脂蛋白分子中的一種酶，可降低氧化脂質水平，部分水解脂質過氧化物，減少氧化型脂質積聚，具有抗氧化的作用，對2型糖尿病微血管病變的發(fā)生有重要的影響。C反應蛋白是機體非特異性炎癥中的最敏感指標，其導致DN的發(fā)病機制可能為慢性炎癥造成腎血管內皮細胞和系膜細胞的損害等多種途徑使腎臟損傷;炎癥反應可引發(fā)機體的氧化應激，產生脂質過氧化物如MDA，導致腎組織細胞膜的生理狀態(tài)被破壞，血管通透性增加，造成腎損害［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)血清對氧磷酶、C反應蛋白等對糖尿病腎病有較好的診斷價值。

在后續(xù)的實驗中，對鑒定出的差異蛋白功能深入研究，擴大樣本量，將有助于闡明這些蛋白質在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用機制，進一步明確糖尿病腎病早期診斷的分子標志物，為早期治療及改善預后奠定基礎。

［1］Collins AJ，Kasiske B，Herzog C，etal.Excerpts from the United States Renal Data System 2004 annual data report:Atlas of endstage renal disease in the United States［J］.Am J Kidney Dis，2005，45(1):A5－A7.

［2］Deng L，Jia HL，Liu CW，etal.Analysis of differentially expressed proteins involved in hand，foot and mouth disease and normal sera［J］.Clin Microbiol Infect，2012，18(6):E18－196.

［3］Shi Y，Deng X，Zhan Q，etal.A Prospective proteomicbased study for identifying potential biomarkers for the diagnosis of cholangio carcinoma［J］.J Gastrointest Surg，2013，20(6):678－680.

［4］Gorg A，Obermaier C，Boguth G，etal.The current state of two－dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients［J］.E-lectrophoresis，2000，21(6):1037－1053.

［5］王海燕.腎臟病學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:414－421.

［6］Witzmann F，Clack J，F(xiàn)ultz C，etal.Two-dimensional electrophoretic mapping of hepatic and renel stress proteins［J］.Electrophroesis，1995，16(3):451－459.

［7］Pinizzollo M，Castillo E，F(xiàn)iaux M，etal.Paraoxonase 2 polymorphism are associated with diabetic nephropathy in typeⅡdiabetes［J］.Diabetologia，2001，1(44):104－107.

［8］Kashihara N，Hatuna Y，Kondeti VK，etal.Oxidative stress in diabetic nephropathy［J］.Curr Med Chem，2010，17(34):4256－4269.