豬源沙門氏菌的分離與耐藥性分析

狄文婷等

摘要：采集遼寧省大連市各大農貿批發市場鮮豬肉68份，用選擇性培養基SS瓊脂培養基分離沙門氏菌，通過菌落形態及PCR方法對分離菌株進行鑒定，利用肉湯微量稀釋法藥敏試驗檢測沙門氏菌對9大類15種抗生素的耐藥性。結果表明：共獲得鮮豬肉樣品沙門氏菌12株，檢出率為17.6%；91.7%鮮豬肉樣品中的沙門氏菌至少耐受1種抗菌藥，耐藥率最高的抗生素為氟苯尼考（75.0%）、鹽酸沙拉沙星（66.7%）、硫酸新霉素（66.7%）和鹽酸多西環素（667%），其次為土霉素（58.3%）、硫酸慶大霉素（58.3%）、乙酰甲喹（58.3%），耐藥率較低的有乳酸環丙沙星（500%）、恩諾沙星（50.0%）、鹽酸環丙沙星（50.0%）、硫氰酸紅霉素（41.7%）、阿莫西林（16.7%）、硫酸黏菌素（16.7%）；大連市農貿批發市場鮮豬肉的沙門氏菌檢出率較高，并且沙門氏菌對各類抗生素表現出了很高的耐藥性，這種高耐藥性也可能通過食物鏈傳遞給人類，應該引起足夠重視。

關鍵詞：豬肉；沙門氏菌；耐藥性；大連

中圖分類號： R155.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0278-02

收稿日期：2013-11-07

基金項目：大學生創新創業訓練計劃（編號：S2013010）；大連民族學院“太陽鳥項目”（編號：tyn13102）。

作者簡介：狄文婷（1989—），女，黑龍江齊齊哈爾人，從事食品質量與安全研究。E-mail：942859228@qq.com。

通信作者：杜雄偉，博士，講師。E-mail：dxw@dlnu.edu.cn。沙門氏菌屬（Salmonella）是革蘭氏陰性、無芽孢、無莢膜、周身鞭毛、能運動的需氧或兼性厭氧的短桿菌[1]。目前可以確定，除沙門氏菌活菌引起感染型中毒以外，沙門氏菌產生的腸毒素也是導致出現中毒癥狀的原因。沙門氏菌中毒主要是由動物性食品引起的，其中魚、乳、蛋也極易引發較嚴重的食源性疾病[2]。然而，隨著沙門氏菌被不斷研究和鑒定及其在養殖業中引發疾病，在養殖過程中為預防沙門氏菌引起的疾病，隨意給家禽、家畜投放抗菌藥，導致出現耐藥菌和多重耐藥現象，其耐藥譜也越來越廣。因此，通過耐藥性試驗掌握沙門氏菌的耐藥譜，從而指導臨床醫學用藥，對食品安全具有重要意義。由于沙門氏菌及其耐藥性能夠在整個食物鏈傳遞，由食品傳遞到人，因此檢測鮮肉中的沙門氏菌，并且通過藥敏試驗測定某種抗菌藥物對其抑菌濃度十分必要。近年來食源性沙門氏菌的鑒定檢測已經在國內外相關領域得到重視和研究，馬國柱等[3-6]研究過陜西省、河南省的食源性沙門氏菌，其他相關研究未見報道[7]。本研究對遼寧省大連市豬源性沙門氏菌進行分離，對9類15種抗生素進行藥敏性分析，旨在為做好大連地區豬源性食品安全工作提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株2012年10月至2013年9月采集大連市開發區金瑪、金發地等大型農貿市場和超市的新鮮豬肉樣品68份，分離出可疑菌株12株。對照菌株為E.coil ATCC25922。

1.1.2抗生素氯霉素類：Flo氟苯尼考（98.4%）。氨基糖苷類：Neo硫酸新霉素（696 U/mg），Gen硫酸慶大霉素（610 U/mg）。青霉素類：Amo阿莫西林（96.4%）。喹諾酮類：Nia煙酸諾氟沙星（99%），Sar鹽酸沙拉沙星（98%），CL乳酸環丙沙星（98.6%），Enr恩諾沙星（99.1%），CH鹽酸環丙沙星（98.8%）。大環內酯類：Thi硫氰酸紅霉素（780 U/mg）。磺胺類：Sul磺胺間甲嘧啶鈉（99.2%）。多黏菌素：Col硫酸黏菌素（19 578 U/mg）。四環素類：Oxy土霉素（96.1%），Dox鹽酸多西環素（合多西環素92%）。人工合成的抗菌獸藥：Meq乙酰甲喹（99.1%）。

1.2方法

1.2.1采樣準備工作：準備封口膜若干，用乙醇棉擦拭內部表面，達到殺菌效果；準備營養肉湯和若干試管，將9 mL營養肉湯加到試管內，塞好，并在121 ℃條件下高壓滅菌 30 min。去市場上采樣時注意雜菌污染，每份樣品用1個封口膜裝好，并標號做相應記錄。每次采樣完成后，打開超凈工作臺的紫外燈滅菌30 min，然后將封口膜內的肉樣品剪成 2～3 粒黃豆大小的肉粒放到滅菌后的營養肉湯試管里，最后將試管放到搖床里，36 ℃、150 r/min條件下培養18～24 h。

1.2.2選擇性培養和增菌（1）準備工作：在無菌操作臺內進行紫外滅菌30 min，將SS培養基以及培養皿（進行包扎）在121 ℃條件下高壓滅菌30 min；之后在無菌操作臺上傾倒培養基并標號；取出搖床上的試管，在無菌操作臺上分別對應標號劃線接種于SS培養基（現購），在（36±1） ℃下倒置培養18～24 h[8]；將無菌操作臺進行紫外滅菌30 min，將若干EP管、營養肉湯、移液槍頭以及牙簽包好，在121 ℃條件下高壓滅菌30 min。（2）一次增菌：在超凈臺內用移液槍加1 mL營養肉湯于EP管內，取出恒溫培養箱內的培養皿，用接種針挑取單菌落接種到EP管內；然后用封口膜包好EP管，36 ℃、150 r/min條件下培養18～24 h。（3）二次增菌：一次增菌 18～24 h 后，在無菌操作臺里用移液槍加1 mL營養肉湯到新滅過菌的EP管，取出搖床里的EP管，用接種環接種到新EP管里；然后將舊EP管用封口膜包好，與30%～50%甘油按照3 ∶1比例混勻，在-20 ℃條件下保存備用；將新EP管用封口膜包好，36 ℃、150 r/min條件下培養18～24 h。

1.2.3PCR試驗準備1盆冰塊。打開水浴鍋燒到100 ℃，將蒸餾水、移液槍頭在121 ℃條件下滅菌30 min，打開無菌操作臺紫外滅菌30 min。取出二次增菌的EP管，1 000 r/min 離心3 min。取出EP管，在超凈臺里倒出上清液，用移液槍吸取200 μL無菌水于EP管內，清洗2次。再加入200 μL無菌水。在水浴鍋內煮10 min，然后在冰塊里冷卻5 min，最后在1萬r/min 條件下離心5 min.然后按照PCR試劑盒的要求按順序加樣，將處理好的樣品加好后放入PCR儀中，設定程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性，退火（不同引物溫度不同），72 ℃延伸，30～35個循環；72 ℃延伸10 min，最后16 ℃保存即可[9]。 PCR反應完成后進行電泳試驗。凝膠板的制作：TAE×1 2 mL+瓊脂糖1 g+蒸餾水 98 mL，加熱使瓊脂糖完全融化；將液體倒入電泳槽，冷卻成型后即可。用10 μL樣品和2 μL Buffer進行電泳試驗點樣。點樣完成后，在U=400 V、I=95 mA、W=38、T=1 h的條件下進行試驗。電泳完成后在復紅染色液中浸泡30 min，在紫外燈光下觀察、照相、記錄[10]。結果沙門氏菌的條帶長度是286 bp。

1.2.4藥敏試驗將營養肉湯、試管、培養皿、移液槍頭在121 ℃、30 min條件下滅菌；96孔板用75%乙醇進行殺菌，再在無菌操作臺上用紫外線殺菌30 min[11]；所有藥品濃度均配制成5.12 g/L，-20 ℃保存于10 mL EP管中[12]。取1 mL藥品加入含9 mL營養肉湯的試管中，此時藥品濃度為512 mg/L。取20 μL菌液和約20 mL營養肉湯于培養皿中備用。96孔板中的所用孔都用移液排槍加100 μL營養肉湯，取100 μL的512 mg/L藥品加到96孔板第1排，攪勻，取第1排溶液100 μL加到第2排，以此類推，使最后所有孔均為100 μL。最后每孔加入100 μL菌液。此時第1排藥品濃度為128 mg/L，第2排藥品濃度為64 mg/L。以此類推，第3～12排藥品濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/L。將96孔板放在36 ℃恒溫箱中培養12 h，觀察結果。

2結果與分析

2.1鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定結果

本研究共獲得鮮豬肉樣品68份，分離12株沙門氏菌，分

離率為17.6%。在大連市開發區農副產品批發市場，沙門氏菌表現出了很高的污染率，其他時間在其他農貿市場采集的樣品未出現被沙門氏菌污染情況。沙門氏菌是引發食源性疾病最常見的致病菌之一，本研究結果表明，應對市場流通的鮮肉產品引起高度重視。本研究中分離樣品污染沙門氏菌的主要原因有2個：其一，農貿市場環境為沙門氏菌的生長創造了良好條件，未經消毒而使用的工具污染鮮肉；其二，生豬在宰殺前已經感染沙門氏菌。從68份市場豬肉中分離12株沙門氏菌，可見市場豬肉污染十分嚴重，應該加強豬肉屠宰、運輸、加工、貯存及銷售等環節的管理，防止病原菌污染。

豬源沙門氏菌顯示了很高的耐藥性，至少可以耐受1種抗菌藥物，有的甚至可以耐受6～7種抗菌藥物，雖然耐藥率較低，但是沙門氏菌的多重耐藥已經成為普遍現象。沙門氏菌的高耐藥性不止表現在食品、畜禽上，還會通過食物鏈傳遞到人類，使人產生對抗生素的耐藥性，從而加大對食源性疾病的治療難度，因此應加強對食品和藥品的監測。

參考文獻：

[1]Yang B W，Qu D，Zhang X L，et al. Prevalence and characterization of Salmonella serovars in retail meats of marketplace in Shaanxi，China[J]. International Journal of Food Microbiology，2010，141（1/2）：63-72.

[2]張華. 動物性產品中沙門氏菌的危害及控制措施[J]. 中國動物保健，2004（6）：8-10.

[3]馬國柱，王安禮，劉長宏，等. 2002年陜西省食品中食源性致病菌監測[J]. 中國食品衛生雜志，2003，15（6）：489-491.

[4]張芳，馬國柱，潘立，等. 陜西省2002—2006年食源性致病菌污染狀況[J]. 中國公共衛生，2008，24（2）：222-224.

[5]張秀麗，廖興廣，郝宗宇，等. 2006—2007年河南省生肉食品中沙門菌的主動監測及其DNA指紋圖譜庫的建立[J]. 中國衛生檢驗雜志，2009，19（7）：1545-1548.

[6]楊保偉，曲東，申進玲，等. 陜西食源性沙門氏菌耐藥及相關基因[J]. 微生物學報，2010，50（6）：788-796.

[7]楊保偉，張秀麗，曲東，等. 2007—2008陜西部分零售畜禽肉沙門氏菌血清型和基因型[J]. 微生物學報，2010，50（5）：654-660.

[8]劉華偉，馬立農，郭藹光，等. 畜禽及環境中沙門氏菌的PCR快速檢測與控制[J]. 家畜生態學報，2005，26（2）：59-62.

[9]劉渠，劉衡川，李灶平，等. 食品中沙門氏菌的耐藥性研究[J]. 現代預防醫學，2004，31（3）：330-332.

[10]陳弟詩，郭萬柱，徐志文，等. 豬霍亂沙門氏菌的分離與鑒定以及PCR檢測方法的建立[J]. 安徽農業科學，2007，35（20）：6020-6023.

[11]關文英，申志新，張淑紅，等. 河北省食品中沙門氏菌的耐藥性研究[J]. 現代預防醫學，2006，33（10）：1761-1763.

[12]王娟，曲志娜，趙思俊，等. 禽源大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性研究[J]. 中國動物檢疫，2009，26（5）：64-65.

1.2.4藥敏試驗將營養肉湯、試管、培養皿、移液槍頭在121 ℃、30 min條件下滅菌；96孔板用75%乙醇進行殺菌，再在無菌操作臺上用紫外線殺菌30 min[11]；所有藥品濃度均配制成5.12 g/L，-20 ℃保存于10 mL EP管中[12]。取1 mL藥品加入含9 mL營養肉湯的試管中，此時藥品濃度為512 mg/L。取20 μL菌液和約20 mL營養肉湯于培養皿中備用。96孔板中的所用孔都用移液排槍加100 μL營養肉湯，取100 μL的512 mg/L藥品加到96孔板第1排，攪勻，取第1排溶液100 μL加到第2排，以此類推，使最后所有孔均為100 μL。最后每孔加入100 μL菌液。此時第1排藥品濃度為128 mg/L，第2排藥品濃度為64 mg/L。以此類推，第3～12排藥品濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/L。將96孔板放在36 ℃恒溫箱中培養12 h，觀察結果。

2結果與分析

2.1鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定結果

本研究共獲得鮮豬肉樣品68份，分離12株沙門氏菌，分

離率為17.6%。在大連市開發區農副產品批發市場，沙門氏菌表現出了很高的污染率，其他時間在其他農貿市場采集的樣品未出現被沙門氏菌污染情況。沙門氏菌是引發食源性疾病最常見的致病菌之一，本研究結果表明，應對市場流通的鮮肉產品引起高度重視。本研究中分離樣品污染沙門氏菌的主要原因有2個：其一，農貿市場環境為沙門氏菌的生長創造了良好條件，未經消毒而使用的工具污染鮮肉；其二，生豬在宰殺前已經感染沙門氏菌。從68份市場豬肉中分離12株沙門氏菌，可見市場豬肉污染十分嚴重，應該加強豬肉屠宰、運輸、加工、貯存及銷售等環節的管理，防止病原菌污染。

豬源沙門氏菌顯示了很高的耐藥性，至少可以耐受1種抗菌藥物，有的甚至可以耐受6～7種抗菌藥物，雖然耐藥率較低，但是沙門氏菌的多重耐藥已經成為普遍現象。沙門氏菌的高耐藥性不止表現在食品、畜禽上，還會通過食物鏈傳遞到人類，使人產生對抗生素的耐藥性，從而加大對食源性疾病的治療難度，因此應加強對食品和藥品的監測。

參考文獻：

[1]Yang B W，Qu D，Zhang X L，et al. Prevalence and characterization of Salmonella serovars in retail meats of marketplace in Shaanxi，China[J]. International Journal of Food Microbiology，2010，141（1/2）：63-72.

[2]張華. 動物性產品中沙門氏菌的危害及控制措施[J]. 中國動物保健，2004（6）：8-10.

[3]馬國柱，王安禮，劉長宏，等. 2002年陜西省食品中食源性致病菌監測[J]. 中國食品衛生雜志，2003，15（6）：489-491.

[4]張芳，馬國柱，潘立，等. 陜西省2002—2006年食源性致病菌污染狀況[J]. 中國公共衛生，2008，24（2）：222-224.

[5]張秀麗，廖興廣，郝宗宇，等. 2006—2007年河南省生肉食品中沙門菌的主動監測及其DNA指紋圖譜庫的建立[J]. 中國衛生檢驗雜志，2009，19（7）：1545-1548.

[6]楊保偉，曲東，申進玲，等. 陜西食源性沙門氏菌耐藥及相關基因[J]. 微生物學報，2010，50（6）：788-796.

[7]楊保偉，張秀麗，曲東，等. 2007—2008陜西部分零售畜禽肉沙門氏菌血清型和基因型[J]. 微生物學報，2010，50（5）：654-660.

[8]劉華偉，馬立農，郭藹光，等. 畜禽及環境中沙門氏菌的PCR快速檢測與控制[J]. 家畜生態學報，2005，26（2）：59-62.

[9]劉渠，劉衡川，李灶平，等. 食品中沙門氏菌的耐藥性研究[J]. 現代預防醫學，2004，31（3）：330-332.

[10]陳弟詩，郭萬柱，徐志文，等. 豬霍亂沙門氏菌的分離與鑒定以及PCR檢測方法的建立[J]. 安徽農業科學，2007，35（20）：6020-6023.

[11]關文英，申志新，張淑紅，等. 河北省食品中沙門氏菌的耐藥性研究[J]. 現代預防醫學，2006，33（10）：1761-1763.

[12]王娟，曲志娜，趙思俊，等. 禽源大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性研究[J]. 中國動物檢疫，2009，26（5）：64-65.

1.2.4藥敏試驗將營養肉湯、試管、培養皿、移液槍頭在121 ℃、30 min條件下滅菌；96孔板用75%乙醇進行殺菌，再在無菌操作臺上用紫外線殺菌30 min[11]；所有藥品濃度均配制成5.12 g/L，-20 ℃保存于10 mL EP管中[12]。取1 mL藥品加入含9 mL營養肉湯的試管中，此時藥品濃度為512 mg/L。取20 μL菌液和約20 mL營養肉湯于培養皿中備用。96孔板中的所用孔都用移液排槍加100 μL營養肉湯，取100 μL的512 mg/L藥品加到96孔板第1排，攪勻，取第1排溶液100 μL加到第2排，以此類推，使最后所有孔均為100 μL。最后每孔加入100 μL菌液。此時第1排藥品濃度為128 mg/L，第2排藥品濃度為64 mg/L。以此類推，第3～12排藥品濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/L。將96孔板放在36 ℃恒溫箱中培養12 h，觀察結果。

2結果與分析

2.1鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定結果

本研究共獲得鮮豬肉樣品68份，分離12株沙門氏菌，分

離率為17.6%。在大連市開發區農副產品批發市場，沙門氏菌表現出了很高的污染率，其他時間在其他農貿市場采集的樣品未出現被沙門氏菌污染情況。沙門氏菌是引發食源性疾病最常見的致病菌之一，本研究結果表明，應對市場流通的鮮肉產品引起高度重視。本研究中分離樣品污染沙門氏菌的主要原因有2個：其一，農貿市場環境為沙門氏菌的生長創造了良好條件，未經消毒而使用的工具污染鮮肉；其二，生豬在宰殺前已經感染沙門氏菌。從68份市場豬肉中分離12株沙門氏菌，可見市場豬肉污染十分嚴重，應該加強豬肉屠宰、運輸、加工、貯存及銷售等環節的管理，防止病原菌污染。

豬源沙門氏菌顯示了很高的耐藥性，至少可以耐受1種抗菌藥物，有的甚至可以耐受6～7種抗菌藥物，雖然耐藥率較低，但是沙門氏菌的多重耐藥已經成為普遍現象。沙門氏菌的高耐藥性不止表現在食品、畜禽上，還會通過食物鏈傳遞到人類，使人產生對抗生素的耐藥性，從而加大對食源性疾病的治療難度，因此應加強對食品和藥品的監測。

參考文獻：

[1]Yang B W，Qu D，Zhang X L，et al. Prevalence and characterization of Salmonella serovars in retail meats of marketplace in Shaanxi，China[J]. International Journal of Food Microbiology，2010，141（1/2）：63-72.

[2]張華. 動物性產品中沙門氏菌的危害及控制措施[J]. 中國動物保健，2004（6）：8-10.

[3]馬國柱，王安禮，劉長宏，等. 2002年陜西省食品中食源性致病菌監測[J]. 中國食品衛生雜志，2003，15（6）：489-491.

[4]張芳，馬國柱，潘立，等. 陜西省2002—2006年食源性致病菌污染狀況[J]. 中國公共衛生，2008，24（2）：222-224.

[5]張秀麗，廖興廣，郝宗宇，等. 2006—2007年河南省生肉食品中沙門菌的主動監測及其DNA指紋圖譜庫的建立[J]. 中國衛生檢驗雜志，2009，19（7）：1545-1548.

[6]楊保偉，曲東，申進玲，等. 陜西食源性沙門氏菌耐藥及相關基因[J]. 微生物學報，2010，50（6）：788-796.

[7]楊保偉，張秀麗，曲東，等. 2007—2008陜西部分零售畜禽肉沙門氏菌血清型和基因型[J]. 微生物學報，2010，50（5）：654-660.

[8]劉華偉，馬立農，郭藹光，等. 畜禽及環境中沙門氏菌的PCR快速檢測與控制[J]. 家畜生態學報，2005，26（2）：59-62.

[9]劉渠，劉衡川，李灶平，等. 食品中沙門氏菌的耐藥性研究[J]. 現代預防醫學，2004，31（3）：330-332.

[10]陳弟詩，郭萬柱，徐志文，等. 豬霍亂沙門氏菌的分離與鑒定以及PCR檢測方法的建立[J]. 安徽農業科學，2007，35（20）：6020-6023.

[11]關文英，申志新，張淑紅，等. 河北省食品中沙門氏菌的耐藥性研究[J]. 現代預防醫學，2006，33（10）：1761-1763.

[12]王娟，曲志娜，趙思俊，等. 禽源大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性研究[J]. 中國動物檢疫，2009，26（5）：64-65.