鋅指E盒結合同源框2在人牙髓組織和細胞的表達*

陳麗虹 舒 珊 陳麗紅 韋 曦

轉化生長因子-β(trans-forming growth factor-β,TGF-β)為一種多肽類生長因子，可調節細胞的增殖、分化、凋亡、黏附和遷移，刺激成纖維細胞分裂。Smad是TGF-β家族信號傳導的下游因子，介導TGF-β信號由胞質傳入胞核。鋅指E盒結合同源框2(zinc-finger E-box binding homeobox 2,ZEB2)屬于ZEB家族，又稱Smad結合蛋白1(Smad-interacting protein1,SIPl)，是一類核轉錄因子[1]。ZEB2可結合TGF-β信號通路中的R-Smad，在TGF-β信號刺激下，ZEB2與R-Smad-Smad4復合體直接結合，調控下游靶基因的轉錄[2]。

在一定條件下，牙髓細胞可分化為成牙本質樣細胞，形成修復性牙本質以保護牙髓牙本質復合體。TGF-β1在牙髓細胞和成牙本質細胞均可合成，牙髓受到刺激或損傷時分泌進入牙髓組織的TGF-β1能夠促進牙髓細胞增殖，分泌細胞外基質，誘導牙髓細胞向成牙本質細胞分化，并已證實hDPCs的分化可由TGF-β1/Smad信號通路介導，但ZEB2在人牙髓組織和細胞中的表達以及與TGF-β1的作用關系尚不明確[3]。本實驗采用FISH觀察ZEB2在牙髓組織的定位和表達，RT-qPCR和FISH檢測ZEB2在正常和TGF-β1刺激hDPCs中的表達，為進一步探討ZEB2在hDPCs成牙本質向分化中的作用提供實驗證據。

1.材料與方法

1.1 主要材料和設備 DMEM低糖培養基(Gibco，美國)；標準胎牛血清FBS，I型膠原酶，0.25%胰蛋白酶，0.02%乙二胺四乙酸(Gibco,澳大利亞)；青鏈霉素(Sigma，美國)；培養瓶、培養孔板(Corning，美國)；TGF-β1(Peprotech，美國)；Trizol試劑(Invitrogen，美國)；反轉錄cDNA合成試劑盒，SYBR Green I Master，LightCycler480熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)；4%多聚甲醛(含0.1%DEPC水)、Triton X-100、甲酰胺、無水乙醇、0.1%DEPC水、探針雜交液、DAPI染色液、熒光原位雜交探針(柏信生物有限公司)，抗熒光衰減封片劑，超微量高精度分光光度計Nanodrop ND-2000(Thermo，美國)，Axio observer Z1熒光倒置顯微鏡(Zeiss，德國),LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人牙髓組織切片的制備 經患者知情同意收集中山大學附屬口腔醫院口腔頜面外科就診患者中因阻生或正畸需要拔除的健康第三磨牙(患者年齡18-25歲，無系統性疾病，牙周狀況良好，近兩個月內未服用免疫制劑和抗生素)，將新鮮收集的第三磨牙劈開后置入預冷的4%多聚甲醛溶液中，4℃固定3d，后置入10%EDTA脫鈣液3-4個月，選擇來源于不同患者的三個牙齒進行梯度酒精脫水，石蠟包埋，制作4μm厚的石蠟切片。

1.2.2 熒光原位雜交技術(FISH)檢測ZEB2在正常牙髓組織的定位和表達 ZEB2熒光探針按以下序列合成：5‘-TGGTGAAATGAGGGCTTGCGA-3’，3’末端標記6-羧基熒光素(6-FAM)。牙髓組織石蠟切片脫蠟，梯度酒精復水，30%亞硫酸氫鈉液處理20min，25mg/ml蛋白酶K孵育40min，洗滌，梯度酒精脫水，風干。探針變性，雜交緩沖液與探針混合后逐滴加入至組織切片。37℃雜交過夜。50%甲酰胺與2倍檸檬酸鈉緩沖液(2XSSC)洗滌，梯度酒精脫水。DAPI染色，生理鹽水洗滌，風干。抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。陰性對照組按以上條件處理但不加入探針。

1.2.3 人牙髓細胞的培養 收集中山大學光華口腔醫學院口腔頜面外科18-25歲因正畸或阻生需要拔除的健康恒牙(患者均知情同意)，消毒后沿牙頸部劈開取出牙髓，去除根尖1/3根髓后，剪成1*1mm2大小的組織塊，3.3mg/mlⅠ型膠原酶37℃消化15min后離心，將組織塊鋪于培養瓶底，加入含20%胎牛血清的DMEM培養基，倒置于37℃、5%CO2培養箱6-8h，待組織塊貼壁后翻轉培養瓶。倒置顯微鏡下觀察，待細胞生長至70%-80%匯合，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后按1：2比例傳代。傳代細胞置于37℃常規培養箱，2-3d換液。

1.2.4 實時熒光定量PCR 使用DMEM培養基配制含TGF-β1的細胞培養液，濃度設定為0、2.5、5、10、20ng/ml，取生長良好的hDPCs接種至6孔板(每孔細胞數為2×105)，每組三孔，在含10%胎牛血清的細胞培養液中培養24h后，加入含不同濃度TGF-β1的細胞培養液繼續培養24h后，細胞生長約達到六孔板的70%-80%。RT-qPCR檢測ZEB2 mRNA的相對表達量，確定最大效應濃度。根據上一步確定TGF-β1的最大效應濃度為5ng/ml，實驗組以5ng/ml TGF-β1 刺激培養 0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h，對照組不加入TGF-β1，檢測hDPCs中ZEB2 mRNA的相對表達量。Trizol試劑提取總RNA，超微量高精度分光光度計測量總RNA濃度。引物的設計及合成均由上海英濰捷基貿易有限公司完成，引物序列見表1。使用1μg體系反轉錄總RNA成為cDNA，20μl體系進行 PCR擴增。PCR擴增40個循環，包括10min預變性，95℃變性，60℃退火，72℃延伸及10min的延伸。采用2-△△Ct法進行數據分析。

表1 本實驗所用的R T-P C R引物序列

1.2.5 FISH技術檢測ZEB2在正常和TGF-β1刺激hDPCs的定位和表達 分別取正常和5ng/ml TGF-β1培養24h的細胞做爬片，4%多聚甲醛(含0.1%DEPC水)固定20min，蒸餾水洗，0.5%Triton X-100通透15min，PBS洗滌，酒精脫水。分別進行探針變性，雜交緩沖液與探針混合后逐滴加入至細胞爬片，37℃雜交過夜。50%甲酰胺與2倍檸檬酸鈉緩沖液(2XSSC)洗滌，酒精脫水。DAPI染色，生理鹽水洗滌，風干。抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。陰性對照組按以上條件處理但不加入探針。

1.3 統計學分析 采用統計學軟件SPSS 13.0進行數據分析。先檢驗各樣本方差齊性，若符合方差分析條件，兩組間比較采用t-test，若不符合方差分析條件則使用秩和檢驗。使用LSD和Dunnett檢驗進行組間兩兩比較。檢驗水準為雙側α=0.05，p值小于0.05被認為有統計學意義。

2.結果

2.1 ZEB2在牙髓組織中ZEB2的定位和表達 如圖1所示，實驗組中ZEB2陽性表達主要集中于成牙本質細胞層，呈綠色熒光，牙髓細胞中表達較弱；陰性對照組未見ZEB2陽性染色細胞。

圖1 ZEB2在正常人牙髓組織的FISH檢測(激光共聚焦顯微鏡，×200)

2.2 實時熒光定量PCR檢測ZEB2在不同濃度TGF-β1作用下的表達：隨TGF-β1劑量增加，hDPCs中ZEB2 mRNA的表達逐漸上調，5ng/ml達最大(P＜ 0.05)，10-20ng/ml有下降趨勢，見表2。

表2 不同濃度TGF-β1培養hDPCs 24h后ZEB2m RNA的表達(×10-4)()

表2 不同濃度TGF-β1培養hDPCs 24h后ZEB2m RNA的表達(×10-4)()

注：與0ng/ml和20ng/ml對照組比較，*P＜0.05

濃度(ng/ml) 樣本量 ZEB2031.00±0.002.5 3 1.21±0.10532.14±0.09*10 3 1.98±0.1220 3 1.82±0.09

2.3 實時熒光定量PCR結果顯示 5ng/ml TGF-β1刺激hDPCs 0-72h，與相同時間點對照組比較，ZEB2 mRNA表達均有上調(P＜0.05)；實驗組中隨時間增加，ZEB2 mRNA相對表達量逐漸上升，24h達峰值(P＜0.05)，隨后表達有所降低，結果見表3。

表3 5ng/ml TGF-1刺激h DPCs后ZEB2m RNA的表達(×10-4)()

表3 5ng/ml TGF-1刺激h DPCs后ZEB2m RNA的表達(×10-4)()

注：與同時間點對照組比較，*P＜0.05；與0h、72h實驗組比較，#P＜0.05

組別 樣本量ZEB2實驗組 對照組0h 3 1.00±0.01 1.00±0.002h 3 1.18±0.03* 1.03±0.056h 3 1.47±0.05* 1.06±0.1112h 3 1.90±0.04* 1.10±0.0824h 3 2.28±0.04*# 1.17±0.1048h 3 1.87±0.08* 1.14±0.0572h 3 1.72±0.12* 1.15±0.09

2.4 ZEB2在hDPCs中的定位和表達 如圖2所示，正常hDPCs的胞質和胞核內均可見較淺的綠色熒光，ZEB2在正常hDPCs中呈弱陽性表達，TGF-β1培養24h后，hDPCs中綠色熒光染色變強，胞核表達更為明顯，陰性對照組未見綠色熒光表達。

圖2 ZEB2在hDPCs的FISH檢測(激光共聚焦顯微鏡，×200)

3.討論

ZEB2/SIP1是ZEB轉錄因子家族的重要成員，該基因序列由一個可變區域將兩個相互獨立且高度保守的鋅指結構簇連接構成，ZEB2的鋅指結構具有特異DNA結合活性，而可變區域中的Smad結合區域能與Smad基因的功能結構域-MH2結構域(Mad homology 2 domain)，結合并相互作用，參與TGF-β/Smad信號轉導，影響細胞增殖、分化和凋亡等生物過程[4,5]。ZEB2在人外胚層來源器官包括腦、脊髓、眼、皮膚、心、肝、肺和牙胚等均有表達，Verschueren等[6]研究發現 ZEB2可與 Smad1、Smad2、Smad3及Smad5結合并相互作用，在Smad介導的TGF-β信號轉導通路中發揮一定作用。Lucchini等[6]通過免疫組化檢測到人牙髓細胞中Smad2，Smad3和Smad4蛋白的表達，Smad蛋白是TGF-β受體作用的直接底物，TGF-β信號與細胞表面受體TGF-βRI和TGF-βRII結合，形成三聚體，激活R-Smad(Smad2和Smad3磷酸化)將信號傳導至胞質，R-Smad與Co-Smad(Smad4)結合后，繼而轉移至胞核內與靶基因結合調節相關蛋白合成，使細胞表型和功能發生改變。TGF-β/Smad信號傳導通路中任一環節改變均可導致信號傳導異常，影響TGF-β的細胞生物學效應。

牙髓細胞是含有成牙本質細胞系干細胞的特異細胞群，有一定的增殖和分化能力，較牙髓干細胞易于獲得，可作為牙髓干細胞的細胞代型進行研究[7]，但牙髓細胞的分化能力有限，因此提高牙髓細胞的成牙本質分化能力對促進受損牙髓的修復具有積極意義。TGF-β是誘導成牙本質細胞分化和第三期牙本質形成的主要信號分子，牙本質基質中存在TGF-β，成牙本質細胞受到刺激或損傷時，可導致牙本質基質中的TGF-β釋放并作用于成牙本質細胞，促進第三期牙本質的形成[8，9]。TGF-β有三種異構體，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，研究發現牙髓細胞主要表達TGF-β1，TGF-β1在牙髓損傷后可反應性增加，誘導牙髓細胞的成牙本質向分化[10]。Kalyva等[11]發現富含TGF-β1的生物材料促進修復性牙本質的形成，表明TGF-β1與成牙本質細胞分化及牙本質基質分泌的調節密切相關。Li等[12]研究顯示TGF-β1能誘導細胞極化和基質沉積，致使成牙本質樣細胞的分化和牙本質的形成。

本實驗利用FISH檢測發現牙髓組織中ZEB2主要表達于成牙本質細胞，而牙髓細胞中的表達呈較弱；FISH檢測發現ZEB2在正常hDPCs胞質和胞核內呈弱陽性表達，提示hDPCs中存在ZEB2的表達，ZEB2可能與hDPCs的成牙本質向分化相關。Berx等[13]研究發現腫瘤細胞中，ZEB在腫瘤早期通過抑制抑癌基因，促使細胞增殖；腫瘤后期ZEB影響細胞的極性并誘導其分化。RT-qPCR檢測ZEB2在不同濃度TGF-β1作用下hDPCs中的表達，結果發現在0-5ng/ml范圍內ZEB2 mRNA的表達隨濃度增大而逐漸上調，5ng/ml達最大，10-20ng/ml有下降趨勢，說明5ng/ml是最大作用濃度，以5ng/ml TGF-β1刺激hDPCs 0-72h，與培養相同時間點對照組比較，ZEB2 mRNA表達均有上調；實驗組ZEB2 mRNA在TGF-β1刺激0-24h過程中表達逐漸上調，24h達到高峰，后隨時間延長表達有所降低，提示TGF-β1促進hDPCs中ZEB2的表達，TGF-β1刺激下hDPCs中ZEB2 mRNA的表達可能與TGF-β1受體、TGF-β1的細胞毒性以及其他基因和通路的相互影響有關。Shiba等[14]報道TGF-β1的作用效應不僅與其濃度、作用時相有關，而且與細胞類型、生長狀態也有關系，TGF-β1與細胞膜上相應的受體數量有關，當TGF-β1與其相應受體結合達到飽和后，即使再增加濃度也不能增強其作用；另外，也可能與不同細胞不同生長狀態分泌生長因子的效能有關，隨細胞的生長和增殖加快，細胞密度增大，細胞的分泌作用增強，外源性生長因子的作用反而不顯著。TGF-β1信號的傳導受到機體嚴密的調控，并與其他基因或信號通路存在交叉作用。Gregory等[15]研究發現在侵襲性乳腺導管癌中，ZEB、TGF-β與miR-200三者間可形成反饋環路，ZEB與TGF-β 的表達呈正相關，ZEB、TGF-β 與miR-200的表達呈負相關，促進腫瘤的侵襲及轉移。Burk等[16]發現ZEB能負性調節miR-141和miR-200c的表達，miR-141通過抑制TGF-β下調ZEB的表達，miR-200抑制ZEB轉錄因子活性，TGF-β能通過下調miR-200家族成員誘導ZEB蛋白的表達。本實驗TGF-β1促進ZEB2表達，這與Gregory、Burk等的研究結果相符。FISH檢測觀察到ZEB2在5ng/ml TGF-β1刺激24h后的hDPCs中表達變強，且胞核表達更為明顯，提示TGF-β1刺激可能引起ZEB2由胞質轉位至細胞核，目前對于ZEB2在細胞中定位的研究尚不明確，已有研究表明轉錄因子在胞核胞質的轉位可作為一項重要的細胞調節機制[17]。以上研究提示ZEB2可能參與TGF-β1信號途徑調控牙髓細胞的成牙本質向分化過程。

綜上，本研究發現ZEB2在牙髓組織中主要表達于成牙本質細胞，TGF-β1刺激hDPCs后，ZEB2的表達上調且由胞質向胞核轉位，提示ZEB2可能參與TGF-β1在成牙本質向分化的調控作用，為闡明TGF-β1/Smad信號傳導機理提供新線索，但其在細胞中的作用機制需進一步探索。

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