nHAC/CSH復合犬外周血基質細胞修復種植體周圍骨缺損的組織學觀察

韓 雪 劉洪臣 王東勝 鄂玲玲 吳 霞 周 威

種植牙修復缺失牙不僅恢復了咀嚼功能，美觀效果也可與真牙媲美，已經成為口腔醫學界和缺牙患者的首選。拔牙后即刻種植的優點有：(1)縮短了修復時間；(2)即刻種植修復極大限度保留了骨組織和軟組織外形；(3)可獲得理想的植入位置和角度，使齦乳頭外形大小達到更理想的美學效果。然而，由于拔牙窩形態不規則，種植體與牙槽骨之間存在的空隙影響種植體的初期穩定性。有研究表明，如果空隙大于1mm，種植體-骨的結合率就會明顯減小[1]。近年來，組織工程骨為骨缺損的修復治療另辟蹊徑。由于拔牙窩形態的不規整性，利用可注射組織工程骨能極大滿足即刻種植體周圍不規則的骨缺損。以往的研究表明，納米羥基磷灰石/膠原/硫酸鈣復合材料(nHAC/CSH)與天然骨的組成和空間結構極其相似，具有良好的生物相容性和生物活性[2]。外周血基質細胞(Peripheral blood-acquired mesenchymal progenitorcells，BMPC)易于獲得，與骨髓基質細胞在表征上有許多共同點，同樣具有高度自我更新和多向分化的能力[3]。本實驗即以nHAC/CSH作為犬BMPC的支架載體，將nHAC/CSH-dBMPC復合物注射到犬即刻種植體周圍，觀察體內成骨能力，探討可注射組織工程骨修復即刻種植體周圍骨缺損的可行性。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和設備 L-DMEM培養基、胎牛血清(Gibco公司，美國)，β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸(Sigma公司，美國)，淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品有限公司)，胰酶(Amresco公司，美國)，納米羥基磷灰石/膠原/硫酸鈣(北京奧精生物科技有限公司)，Ti2448合金(中科院金屬研究所提供)。

超凈工作臺(北京昌平凈化設備廠)，CO2恒溫孵箱(Thermo Forma公司，美國)，倒置相差顯微鏡(Leica公司，德國)，E300CP硬組織切片機(Exakt，德國)，SUNITM種植機(Satelec，法國)。

1.2 實驗動物 成年雄性雜種犬4只，體重約15kg(由解放軍軍醫進修學院醫學實驗動物中心提供并飼養)。

1.3 方法

1.3.1 犬BMPC的獲取和培養[4]健康成年犬，肝素化注射器穿刺入前臂靜脈抽血，約15-20mL，用等量L-DMEM培養基稀釋，緩慢加入淋巴細胞分離液表面，離心20min收集中間云霧狀的單個核細胞帶，清洗3次，以5×106/mL密度接種于6孔板，培養液為含10%FBS的L-DMEM，置37℃、5%CO2孵箱培養，每隔3天進行換液。原代培養至貼壁細胞生長近融合后，胰蛋白酶消化，按1：2比例進行接種，置于培養箱中繼續培養，次日更換培養基一次，倒置顯微鏡下觀察細胞的生長增殖情況以及形態變化。

1.3.2 犬BMPC的成骨誘導分化 取第3代細胞，加入含10-8mol/L地塞米松，10mmol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/mL抗壞血酸的成骨誘導液。培養14天后，進行免疫細胞化學染色觀察I型膠原表達情況；培養28d，茜素紅染色觀察鈣結節形成情況。

1.3.3 nHAC/CSH-dBMPC可注射骨的制備 dBMPC成骨誘導2周后，調整細胞濃度達2×106/mL，取0.8ml細胞懸液，與1g nHAC/CSH均勻混合，形成糊狀復合物。

1.3.4 植入試驗 全麻消毒鋪巾后，拔除犬雙側下頜第二、三、四前磨牙，并在拔牙創遠中制備4mm×5mm×6mm箱狀骨缺損，植入圓柱形種植體(直徑3.0mm、高10.0mm)，種植體骨缺損區進行不同處理，空白對照組(control組)：不植入任何材料；單純材料組(nHAC/CSH組)：植入nHAC/CSH；可注射骨組(nHAC/CSH-dBMPC組)：植入nHAC/CSH-dBMPC可注射骨。植入后覆蓋Bio-guid膜，嚴密縫合創口。術后3d每日肌注青霉素160萬U，流食2d，軟食2周，口內縫線任其自行脫落。

1.3.5 取材與觀察 術后12周處死動物取材，固定，甲基丙烯酸甲酯包埋，用E300CP型硬組織切片機及特制夾具，沿種植體長軸切開，將帶種植體的骨組織修切成組織塊，手工制作20μm厚的磨片[5]，經亞甲基藍染色后光學顯微鏡下觀察種植體周圍骨缺損區的骨愈合情況。

2.結果

2.1 dBMPC向成骨細胞誘導 成骨誘導培養14d，I型膠原免疫細胞化學染色陽性，胞漿內出現棕黃色的顆粒，胞核不著色(圖1)。培養28d左右茜素紅染色呈紅色斑塊，為鈣鹽特征性染色(圖 2)。

圖1 成骨誘導14d，犬BMPC I型膠原陽性表達(×100)

圖2 成骨誘導28d，犬BMPC形成的鈣結節(×100)

2.2 大體觀察 實驗犬均存活至取材，傷口愈合良好，種植體無脫落，周圍無紅腫和免疫排斥反應。

2.3 組織學觀察 術后12周，空白組種植體周圍骨缺損區已見新生骨小梁形成，種植體周圍僅為少量直接接觸的編織骨，骨小梁細小(圖3A)，骨結合率為18.271±2.15%；nHAC/CSH組種植體周圍直接接觸的骨組織較多，可見骨小梁較空白組粗大(圖 3B)，骨結合率為 33.131±7.29%；nHAC/CSH-dBMPC組種植體界面可見大量直接接觸的骨組織，界面密合，無纖維組織和空隙存在，皮質骨處可見哈佛氏系統生成，骨結合率為65.031±3.13%(圖3C)。三組之間骨結合率有顯著性差異(圖 4)。

3.討論

近年來，隨著干細胞研究的重大進展及應用材料的完善和發展，利用骨組織工程方法構建良好骨替代物己成為極具臨床應用前景的研究熱點。種子細胞的獲取、培養和支架材料的選擇，是組織工程骨研究的關鍵性環節。CD14+成纖維細胞可以從人外周血單核細胞原代培養出來，和骨髓間充質基質細胞在表征上有許多共同點，同樣具有高度自我更新和多向分化的能力[6]。本實驗利用密度梯度離心法并結合貼壁分離篩選法來分離純化犬外周血基質細胞。

圖3 術后12周的亞甲基藍染色結果

圖4 三組骨結合率(*P＜0.05%)

本實驗培養的犬BMPC經成骨誘導后能使鈣離子以鈣鹽的方式在細胞外面沉積下來，形成鈣結節，茜素紅和鈣發生顯色反應，鈣結節也就被染成了深紅色，茜素紅染色陽性，同時I型膠原免疫細胞化學染色陽性，證明該細胞具有向成骨分化的能力，可作為可注射組織工程骨的種子細胞。

理想的骨修復材料是應具有可降解性、可以被宿主的新骨完全替代[7]。隨著微創外科理論和技術的成熟，支架材料的研究熱點集中于可注射材料的發展。可注射組織工程生物材料除了要求具有一般生物材料的特性：良好的生物相容性及組織相容性，具有生物可降解性，無毒、無不良反應，來源充足，性質穩定，易貯存等特點以外，還必須具有以下特征：(1)一定的流動性；(2)可靠的成骨效應；(3)工藝簡單[8]。

硫酸鈣是一種無機化合物，屬多功能硬性膠凝材料。硫酸鈣用作骨缺損填充修復材料已經達百年之久，其具有良好的生物相容性，已得到眾多實驗的證實[9-11]。硫酸鈣根據其結合水分子量的多少,可分為二水硫酸鈣、半水硫酸鈣和無水硫酸鈣三種形式，其中，因半水硫酸鈣具有更好的強度及降解性能，常被作為骨移植替代材料。由α結晶技術改造的手術級半水硫酸鈣顆粒，無毒，異物反應小，骨膜存在下有成骨效應，可生物降解。同時具有良好的微孔性，可加載干細胞、成骨細胞、生物因子或化療藥物，并能有效地阻止軟組織向缺損部位生長[12]。

基于仿生學原理的納米羥基磷灰石膠原(Nano-sized hydroxyapatite/collagen，n-HAC)由于晶體尺度與天然骨接近，是與天然骨的成分和空間結構極其相似的礦化纖維，具有降解與新骨生長匹配，接近自體骨框架，可供成骨細胞貼附生長增殖等優點，已有大量的研究證明其具有良好的生物活性和生物相容性。為了避免單用一種材料的缺陷，提高硫酸鈣的骨再生性能，清華大學材料科學與工程系將兩種具有互補特征的可降解材料按一定方式組合，變成可注射性的骨水泥，凝固時間適當，約20min，可用于骨再生的應用[2]。和純硫酸鈣相比，添加nHAC能使復合材料的凝固時間延長，顯著提高其可注射性能；更重要的是，nHAC/CSH在模擬體液浸泡后可以誘導產生類骨磷灰石，說明添加nHAC顯著改善了復合材料的生物活性。Liu[2]將該材料植入兔皮下及下頜骨臨界性缺損處進行皮內反應實驗和骨缺損修復實驗，未見紅斑及水腫，nHAC/CSH使兔下頜骨缺損區完全長平。

本實驗將nHAC/CSH作為犬BMPC的支架載體，將nHAC/CSH-dBMPC復合物注射到犬即刻種植體周圍，組織學觀察顯示：空白組種植體周圍骨缺損區已見新生骨小梁形成，種植體周圍僅為少量直接接觸的編織骨，骨小梁細小；nHAC/CSH組種植體周圍直接接觸的骨組織較多，可見骨小梁較空白組粗大；nHAC/CSH-dBMPC組種植體界面可見新生骨組織。統計學分析后發現nHAC/CSH-dBMPC、nHAC/CSH和空白組的BIC存在顯著性差異。

本實驗的研究結果證明了以dBMPC為種子細胞，nHAC/CSH為支架材料構建的組織工程化骨本身具有成骨活性，可在種植體周圍形成新骨，使種植體與組織工程化骨之間形成骨性結合界面。其原因在于nHAC/CSH材料在體內局部pH值降低，導致周圍骨質脫礦缺損，從而導致BMP-2的釋放，刺激骨質生成[13]；nHAC能聚集更多蛋白質，誘導細胞粘附和增殖[14,15]，為細胞成分的生長、細胞外基質的分泌、血管成分的長入提供了理想的條件。還可能與dBMPC具有向血管內皮細胞分化的特性，在體內種植體周圍成骨細胞和成骨前體細胞分泌的多種細胞因子的作用下，dBMPC向血管內皮細胞分化，促進血運重建，為組織工程血管化提供條件。

綜上所述，在本實驗中，我們通過將nHAC/CSH-dBMPC復合體成功用于修復犬下頜骨即刻種植體周圍骨缺損，初步評估了這種新型的可注射骨組織工程復合體在骨缺損修復治療中的潛在價值，為骨組織工程復合體的構建以及應用開辟了一條新的途徑。

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