豬傳染性胃腸炎病毒纖突蛋白抗原表位區的表達及其免疫原性分析

秦志華，張明宇，張傳美，單 虎

（青島農業大學山東省預防獸醫學重點實驗室，山東 青島 266109）

豬傳染性胃腸炎(TGE)是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，以嘔吐、嚴重水樣腹瀉、脫水為特征。目前，世界上大多數國家免疫接種弱毒疫苗防治TGE，然而這些常規疫苗免疫存在成本高、易返祖、有潛在感染危險等缺陷[1]。因此，現在許多國家都在致力于基因工程疫苗的研究。

豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白突出于病毒粒子外，能夠誘導機體產生保護性中和抗體，起到免疫保護作用[2]。S蛋白上含有A、B、C、D四個主要的抗原位點，所構成的抗原表位區產生的保護作用相當于整個S蛋白[3]。本文正是對S蛋白的抗原表位區進行免疫原性分析，為今后TGEV亞單位疫苗的研制和免疫保護性候選基因的篩選提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及試驗動物 His-Bind蛋白純化回收試劑盒，購自Novagen公司；BamHⅠ和HindⅢ限制性內切酶，rTaq酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；弗式佐劑，購自Sigma公司；體重約18 g，4～6周齡的SPF級昆明系小鼠，購自青島派特福德白鼠養殖專業合作社。

1.2 重組原核表達質粒pET30a-S的構建 根據GenBank收錄的S基因序列（登錄號：EU074218.2），利用Premier 6.0軟件設計一對特異性引物P1：5′-CGGGATCCGGTAACCATTGGAATCTCA-3′，P2：5′-GCGAAGCTTGCAGGAATCTAGGTGTAGC-3′（分別加入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點）。RT-PCR擴增產物大小為1 971 bp，包括S基因的抗原表位區。BamHⅠ和HindⅢ雙酶切連接到pET30a質粒，鑒定后的陽性克隆送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序分析。

1.3 重組質粒的誘導表達 將含重組質粒的菌液按1∶100比例重新接種于新鮮的LB液體培養基，37℃振蕩培養至菌液濃度達OD600=0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，28℃誘導培養5 h，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白表達情況。

1.4 Western-blot分析 將表達產物經半干式電轉印轉膜后，5%BSA封閉PVDF膜過夜，使用抗His標簽兔多克隆抗體作一抗，羊抗兔IgG（HRP）作二抗孵育后進行ECL化學曝光。

1.5 試驗動物分組及血清抗體水平的檢測 將小鼠隨機分成試驗組和對照組，每組12只，其中試驗組小鼠背部皮下注射純化回收后的TGEV S蛋白，對照組注射生理鹽水。初次免疫后每隔14 d加強免疫1次，共免疫3次。初免時蛋白免疫劑量為50 μg/只，加強免疫時蛋白免疫劑量為100 μg/只。分別于首免后第0天，14天，28天，42天采血，抗原包被濃度為2.5 μg/mL，血清抗體稀釋度為1∶200時，間接ELISA檢測免疫后小鼠的抗體水平。

2 結果

2.1 目的片段的擴增，克隆和鑒定 RT-PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見約1 971 bp的片段，與預期目的片段大小相符（見圖1）。測序結果證明，已成功構建pET30a-S重組表達載體。

2.2 重組質粒的誘導表達結果 結果如圖2顯示，有80.4 Ku的與預期大小相符的目的蛋白條帶，而在pET 30a空載體中則沒有出現相應條帶，說明該蛋白條帶是由載體中目的基因所表達的。

2.3 Western-blot分析 經Western-blot鑒定，將轉印好的PVDF膜經一抗二抗孵育，ECL曝光后可見明顯的特異性反應帶（見圖3），說明表達產物具有良好的抗原性。

2.4 抗TGEV血清IgG抗體間接ELISA檢測 從圖4中可以看出，小鼠在免疫接種前均為TGEV抗體陰性。首免后第14天，試驗組小鼠檢測到抗體陽性，說明小鼠在免疫后產生了TGEV特異性抗體，隨著免疫次數的增加，試驗組抗體水平上升明顯。在整個免疫過程中，對照組未檢測到TGEV特異性抗體。

3 討論

纖突（S）蛋白存在抗原位點、抗原亞位點和抗原決定簇3種水平的抗原結構，抗原分A、B、C、D四個位點，這些位點又可分為抗原決定簇，S蛋白共有11個抗原決定簇，其中5個是與中和作用相關的重要抗原決定簇[4]。S蛋白是惟一能誘導產生中和抗體和提供免疫保護作用的結構蛋白，所以S蛋白是基因工程研究的重中之重，尤其近年來國內外研究者在S蛋白的表達方面進行了不斷的探索[6]。考慮到后期疫苗制備過程中的成本和效率問題，本研究初步選定使用原核表達系統進行蛋白表達，由于S基因編碼序列全長為4.35 kb，若對S基因全基因進行克隆，可能會在蛋白表達過程中遇到困難，研究表明，A、B、C、D四個抗原位點誘導產生的保護作用相當于整個S蛋白，因此本試驗結合前者的研究，基于S基因4個位點組成的抗原表位區設計引物，擴增出1 971 bp的目的片段，動物試驗檢測目的蛋白的免疫原性以驗證其是否適合作為基因工程疫苗的潛在基因應用。

現已知TGEV的N蛋白在誘導產生細胞免疫應答中起著重要作用[6]，在接下來的研究中可以設想將S蛋白和N蛋白共同表達。楊恒等[7]研究結果顯示，S、N蛋白融合表達誘導的體液免疫和細胞免疫水平低于S蛋白單獨表達，這可能是因為兩個蛋白融合表達造成蛋白構象改變導致的，在進一步的研究中筆者認為可以嘗試在S、N基因間插入一段接頭序列(Linker)或構建雙啟動子表達載體。

本試驗的結果顯示，以豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白A、B、C、D四個抗原位點所表達的蛋白，能夠刺激機體產生免疫反應，且有一定的效果，初步預示了其作為基因工程疫苗候選基因的可行性，這為豬傳染性胃腸炎的防治提供了一個安全有效的途徑，并為以后研究應用提供了可靠的保障和堅實的理論基礎。

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[7]楊恒，李春華，曹三杰，等.豬傳染性胃腸炎病毒S、N基因核酸疫苗的構建與免疫原性試驗[J].中國獸醫學報，2011，11（31）:1550-1554.