雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素類藥物耐藥性和耐藥基因調(diào)查分析

寧家寶，梁梓森，陳建紅，張濟(jì)培，涂玉蓉，司興奎，牛 森

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東 佛山，528231）

雞白痢（PD）是由雞白痢沙門菌引起雞的一種以雛雞白痢，母雞卵巢炎為特征的典型經(jīng)卵垂直傳播傳染病。該病不但給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的危害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)雞白痢沙門菌可在家禽腸道內(nèi)定植，在加工禽胴體時(shí)會(huì)污染肉質(zhì)，繼而進(jìn)入人類的食物鏈。四環(huán)素作為獸醫(yī)臨床上最為常用的抗菌藥物之一，廣泛的應(yīng)用甚至濫用直接導(dǎo)致了雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素類藥物產(chǎn)生耐藥性。雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生耐藥跟其攜帶的四環(huán)素耐藥基因有關(guān)，目前國(guó)內(nèi)各地區(qū)對(duì)雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素耐藥性及耐藥基因攜帶情況的研究資料相對(duì)較少，為了更好地預(yù)防和治療雞白痢沙門菌病和保障公共衛(wèi)生安全，很有必要加強(qiáng)相關(guān)研究。本課題檢測(cè)分析了珠三角地區(qū)69株雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性和四環(huán)素耐藥基因攜帶情況，目的為闡明雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥機(jī)制提供更為豐富的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 69株雞白痢沙門菌，于2005年7月至2011年7月自珠三角地區(qū)雞群分離，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的雞白痢沙門菌PCR方法[1]進(jìn)行鑒定并保存。藥敏質(zhì)控菌大腸埃希菌ATCC25922，購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心。

1.1.2 藥品與試劑 四環(huán)素為AMRESCO公司產(chǎn)品；pMD18-T Vector、premix Ex Taq酶等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；瓊脂粉和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；LB肉湯粉和木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂粉均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的復(fù)蘇 取-40℃保存的菌種劃線接種于XLD固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)16 h；挑取單個(gè)典型菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床過夜培養(yǎng)。

1.2.2 耐藥性的檢測(cè) 根據(jù)CLSI制定的試驗(yàn)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)操作，以大腸埃希菌ATCC25922作為藥敏質(zhì)控菌株，測(cè)定69株雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥情況。

1.2.3 耐藥基因的檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[2]，分別設(shè)計(jì)合成tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（M）和tet（X）引物，引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度參見表1。參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板作PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體系（25 μL）：Premix Ex Taq 11.5 μL，雙蒸水9.5 μL，DNA模板3 μL，上、下游引物各0.5 μL。循環(huán)參數(shù)：熱蓋5 min，94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火45 s；72℃延伸45 s；35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，16℃保溫，于-20℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在凝膠成像分析儀上觀察電泳結(jié)果。

1.2.4 產(chǎn)物的回收、克隆及測(cè)序 將PCR產(chǎn)物回收純化，與pMD18-T vector于16℃連接2 h后，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在氨芐抗性平板上篩選出可疑陽(yáng)性克隆株送作序列測(cè)定。

表1 引物序列及相關(guān)信息

2 結(jié)果

2.1 受試菌株對(duì)四環(huán)素的耐藥性檢測(cè)結(jié)果 對(duì)耐藥性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示69株雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率為62.3%，MIC50值為128 μg/mL，MIC90值為256 μg/mL。具體見表2、表3。

表2 受試菌MIC試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表3 四環(huán)素抑菌濃度（μg/mL）結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 受試菌株耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析，69株雞白痢沙門菌僅擴(kuò)增出tet（A）1種耐藥基因，檢出率為75.4%(52/69)，未能檢出耐藥基因tet（B）、tet（C）、tet（M）和tet（X）。在43株對(duì)四環(huán)素耐藥的雞白痢沙門菌中，有39株攜帶tetA基因，符合率為90.7%。BLAST比對(duì)測(cè)序結(jié)果表明，所擴(kuò)增出的tetA基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中目的基因序列的相似性大于98%。耐藥基因tetA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

3 討論

3.1 雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性 各種抗生素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致雞白痢沙門菌及其他細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥問題已經(jīng)十分嚴(yán)重[3]。雞白痢沙門菌的耐藥性研究已在國(guó)外得到了高度關(guān)注，國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究資料尚需要豐富。潘志明等[4]報(bào)道了20世紀(jì)80年代江蘇省雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥率上升，20世紀(jì)90年代對(duì)大部分藥物的耐藥率可達(dá)50%以上，有的甚至達(dá)100%。仇莉等對(duì)江蘇東臺(tái)區(qū)70株雞白痢沙門菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其中對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生了較高的耐藥性，耐藥率為47.1%；徐君等[5]檢測(cè)了2008-2009年間從江蘇、鹽城、南通等地區(qū)分離的60株雞白痢沙門菌的耐藥性，結(jié)果顯示，分離株對(duì)四環(huán)素的耐藥率達(dá)63.3%；董洪燕等和嚴(yán)曉玲等[6，7]的檢測(cè)結(jié)果也顯示了雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素耐藥的嚴(yán)重性，耐藥率分別為88%和100%。以上研究均表明，雞白痢沙門菌的耐藥問題已日益突出，對(duì)當(dāng)前食品安全和公共衛(wèi)生領(lǐng)域構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。本研究檢測(cè)69株雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥情況，結(jié)果顯示，有43株分離菌株產(chǎn)生了耐藥，耐藥率達(dá)62.7%，四環(huán)素的MIC50值為128 μg/mL，MIC90值均為256 μg/mL，表明珠三角地區(qū)的雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥情況比較嚴(yán)重，與現(xiàn)有研究報(bào)道結(jié)果相一致。

3.2 雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素耐藥基因的攜帶情況研究報(bào)道表明，tet（A）基因主要位于結(jié)合性質(zhì)粒或者Tn1721等轉(zhuǎn)座子上，該基因在對(duì)四環(huán)素耐藥的沙門菌中廣泛分布，當(dāng)tet基因成為這些可移動(dòng)遺傳成分的一部分，如質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子，它們將很容易從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)[8]。本研究的結(jié)果表明，對(duì)四環(huán)素耐藥的雞白痢沙門菌中所攜帶的四環(huán)素耐藥基因僅有tet（A）基因，與其他研究結(jié)果一致。王曉泉等[9]研究認(rèn)為，18株雞白痢沙門菌僅含有tetA基因，尚有研究稱通過調(diào)查tet基因在雞源沙門菌中的流行性證實(shí)，tet（A）基因是雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌惟一的四環(huán)素耐藥基因。提示tet(A)基因在雞白痢沙門菌中分布非常廣泛，雞白痢沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥機(jī)制以tet（A）基因介導(dǎo)的主動(dòng)外排為主。

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