副雞禽桿菌莢膜多糖的提取及HPLC分析

王雪敏，路迎迎，陳小玲，路明華，張培君，龔玉梅，王宏俊

（1.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所 畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室，北京 海淀 100097；2.河北工程大學農學院，河北 邯鄲 056021；3.河北省禽病工程技術研究中心，河北 邯鄲 056021）

雞傳染性鼻炎是由副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum，Apg)引起的一種急性呼吸道傳染性疾病。主要引起育成雞的生長受阻，增重減慢，雞群的死亡數和淘汰數增加，產蛋率下降給養殖戶帶來了巨大的損失[1]。1920年，由Beach首先報道，該病，1931年DeBlieck初次分離到該病原體，該病目前在世界許多國家和地區都有發生和流行[2]。

莢膜多糖（capusular polysaccharide，CPS）是大分子物質，分離制備比單糖和小分子寡糖更加復雜，高度含水量（＞95%）[3]，它們是由重復單糖通過糖苷鍵連接而成同聚體或異聚體，CPS的結構復雜決定于糖鏈的大小、分枝數目、單糖的組成等。國外有很多關于不同細菌菌株的多糖結構的報道，分子量在萬以上，多為葡萄糖，半乳糖等組成的雜多糖[4]。已有報道多糖是副雞禽桿菌的有效抗原成分，經試驗證，實接種有莢膜副雞禽菌株的動物表現出典型的臨床癥狀，而接種過沒有莢膜副雞禽菌株的動物，卻沒有出現臨床癥狀，這一結果說明莢膜是副雞禽菌的一種重要的毒力因子[5]。CPS單獨活性的研究及開發尚未見報道，鑒于多糖對機體的免疫調節活性具有廣泛影響，本研究將為相關機理的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 Apg B型分離株，由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室分離鑒定并保存。

1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）為BD公司產品；煙酰胺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）為 Amresco公司產品，購自北京百靈克生物技術有限公司，TSA或TSB培養基在使用前均加入終濃度為50 μg/mL的NAD和10%的新生牛血清；濃鹽酸、無水乙酸鈉、無水乙醇、苯酚等均為分析純，購自北京市國藥集團；L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖等標準單糖，均為Sigma公司產品，購自上海化學試劑有限公司，分子量為 4.32 Ku、12.6 Ku、60.6 Ku、110 Ku、410 Ku的葡聚糖標準品，購自中國計量研究所，LC-10A液相色譜儀，購自日本島津有限公司；Nucleosil C18 1005-5NH2 4.6×250mm色譜柱，購自上海優其實業有限公司，Shodex sugar KS-804凝膠色譜柱，購自迪馬科技有限公司；Heidolp旋轉蒸發儀，購自北京康高特科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 副雞禽桿菌的培養 Apg在帶有5%CO2的37℃恒溫培養箱培養，TSA固體培養傳種2代，取多個菌落進行液體培養，在生長9～12 h能達到最佳對數生長期。

1.3.2 Apg B型分離株莢膜染色 運用Anthong莢膜染色法進行[6]，具體操作步驟是：加1滴無菌水于載玻片上，從固體培養基上挑少量對數生長期的菌苔涂成薄層風干，1%結晶紫水溶液染2 min，20%硫酸銅沖洗，吸水紙吸干，立即加1～2滴香柏油于涂片處，顯微鏡鏡檢。

1.3.3 Apg莢膜多糖提取及純化 按3%的比例接種培養基擴大培養，37℃恒溫箱進行攪拌培養，達到對數生長期終止培養，收集10 L TSB液體培養的菌液，用0.25%甲醛滅活后離心去除菌體，上清液濃縮加入適量乙酸鈉和中濃度為25%的無水乙醇，以去除核酸沉淀，4℃過夜后離心收集上清，加入適量乙酸鈉和80%無水乙醇完全沉淀粗多糖，4℃過夜離心[7]。去除雜蛋白：沉淀用0.3 mol/L乙酸鈉溶液溶解，以等體積苯酚-乙酸鈉飽和液離心抽提，此步驟重復4次[8]。吸取上清液用蒸餾水透析去除殘存苯酚，透析后內液加入適量乙酸鈉和80%無水乙醇以沉淀多糖，用無水乙醇及丙酮各洗2次，凍干所收獲的多糖，稱量并進行鑒定及分析。

1.3.4 葡萄糖標準曲線的制備 精確稱取無水葡萄糖0.5 g，蒸餾水定容至1 L，取10只具塞試管，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各加水補至2.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5 mL，搖勻，放置沸水中15 min，取出再放入冷水中，20 min后在波長490 nm處測定吸光度，以蒸餾水做空白對照，以葡萄糖毫克數為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線[9]。

1.3.5 多糖含量的測定 精確稱取莢膜多糖粗制品85 mg，加入1 mL蒸餾水配制儲存溶液，使用時稀釋30倍制成多糖樣品溶液。取制備好的樣品溶液1.0 mL，加入蒸餾水補至2.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5 mL，搖勻，放置沸水中15 min，取出再放入冷水中，20 min后在波長490 nm處測定吸光度，同時做3個重復。根據公式：多糖含量（%）＝［（C×D×F）÷W］×100% 計算多糖在樣本中的含量。C為多糖樣品溶液的濃度（mg/mL），D為樣品的稀釋倍數；F為換算因子（國際F=3.19），W樣為樣品重量。

1.3.6 莢膜多糖的單糖組分分析 稱取干燥10 mg樣品放入安瓶加入3 mol/L鹽酸5 mL封口80℃水解8 h。將水解后的多糖離心過濾去雜質濃縮，色譜分析用1 mL蒸餾水溶解，進樣10 μL，根據標準單糖與樣品的保留時間的比較確定組成單糖的種類。

1.3.7 多糖分子量測定 稱取干燥樣品10 mg用1 mL蒸餾水溶解，離心過濾去雜質，進樣5 μL液相色譜分析，已知標準品分子量和出現波峰時間，對照樣品出現波峰時間來計算出分子量的大小[10]。

2 結果分析

2.1 Apg B型分離株莢膜染色 莢膜染色結果見圖1所示，在圖中能清楚看到細菌的細胞壁外包圍有一層黏性物質，表明體外培養狀態下副雞禽桿菌是有莢膜的。

2.2 經凍干后稱量并計算，粗提Apg莢膜多糖的提取得率為85 mg/L。

2.3 標準曲線的測定 配制好的葡萄糖標準溶液按照不同劑量分別吸出，在加入蒸餾水補齊至2.0 mL，按上述苯酚-硫酸比色法操作，得到不同吸光值。以吸光值為縱坐標，糖濃度為橫坐標繪制標準濃度曲線，結果見表1。由表1得出葡萄糖標準曲線圖，如圖2。

表1 不同濃度葡萄糖的吸光值

2.4 粗提物中多糖含量 根據表1，圖2標準曲線得出回歸方程:y=1.3339X+0.0227，R2=0.994。y為吸光度，X為多糖濃度（mg/mL）。根據葡萄糖標準曲線可以看出在0.0～0.9 mg呈現良好的線性關系。提取莢膜多糖濃度使用回歸方程來計算。莢膜多糖在OD490處測得3次吸收值，取其平均數為0.728，將該平均值帶入回歸方程得出莢膜多糖樣品的濃度為0.529 mg/mL。依據公式：多糖含量（%）＝［（C×D×F）÷W］×100%＝［（0.529×30×3.19）÷85］×100%，得出莢膜多糖的含量為59.6%。

2.5 多糖的單糖組分構成 液相色譜分析單糖構成結果見圖3。從圖3-A標準品單糖出峰時間和峰面積對比，圖3-B圖樣品出峰時間和面積，可以確定Apg B型分離株莢膜多糖主要由L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖組成，圖3-B圖第一個峰為未知糖。

2.6 多糖分子量 分子量測定結果見圖4。其中圖4A從左到右的波峰依次對應分子量為410 Ku、110 Ku、60.6 Ku、12.6 Ku、4.32 Ku，依據標準品分子量大小和其出現波峰的時間，對照B圖樣品出現波峰時間來計算樣品多糖的分子量。本試驗中所測樣品多糖的分子量約為209 Ku左右，圖4C是A圖標準分子量曲線圖，橫軸為標準品所用時間，縱軸為分子量大小。

3 討論

關于副雞禽桿菌莢膜多糖的研究鮮有報道，早在1981年Iritani等研究發現，該菌的粗提多糖含有兩種成分，并對這兩種成分做了相關的活性分析，證實這些成分具有保護活性和型特異性。直到2010年，臺灣也有關于副雞禽桿菌莢膜化學成分的分析，該研究主要發現了外膜基因序列存在兩種基因型[5]，而本文提取純化了副雞禽桿菌的莢膜多糖并首次對其含量、組分、分子量大小作了初步研究。

確定莢膜存在是進行分析鑒定的前提。莢膜染色方法各不相同，要有摸索過程。開始使用墨汁染色法造成莢膜效果不是很理想，最終選擇Anthong莢膜染色法操作更為簡便，莢膜清晰可見并可觀察到莢膜的自然形態，此方法操作簡便省時高效，值得推廣[6]。冷酚蛋白抽提次數增加多糖含量會逐漸降低，抽提5次以上會使莢膜多糖化學結構受到損傷導致多糖指標不合格[7]，抽提1～2次雜質去除不徹底多糖指標不合格，定為4次為最佳抽提條件。本文多糖含量測定，用苯酚-硫酸比色法具有簡單快速無需多糖純品和貴重儀器等優點，此法測定多糖含量其重復性和穩定性好[11-12]。

本試驗運用高效液相色譜分析Apg莢膜多糖的組分，由于沒有相應的標準單糖，目前還無法確定圖3B中出現的第一個峰對應的是哪一種單糖，仍需再進一步的研究加以確定。

本研究應用高效液相色譜分析了多糖的分子量。同條件下分子量越大出峰越早，根據標準葡聚糖出峰時間和分子量大小的對應關系，來計算出樣品出峰時間分子量。在檢測過程中，樣品的純度跟出現的峰是密切相關的，過多雜質會導致試驗結果不理想。

據報道莢膜多糖是細菌中毒力的主要成分之一，但是提取純化后的莢膜多糖只是半抗原，免疫原性弱，往往需要與其他蛋白偶聯后才能發揮免疫作用。有文獻[13]報道，莢膜多糖與菌體蛋白質聯合粗提物的免疫原性明顯高于莢膜多糖本身。因此選擇較為簡單的粗提法，可使濃縮物能夠保持免疫原性，同時也可以在生產過程中降低成本。本研究對探索副雞禽桿菌亞單位疫苗的可行性提供了一定的參考。

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