豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒的臨床應(yīng)用研究

徐 璐，范學(xué)政，梁智選，陳 靜，余 勇，熊仲良，吳赟竑，寧宜寶，鄭 然，趙啟祖，王 琴

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081；2.天津市動物疫病預(yù)防控制中心，天津 北辰 300402；3.山東省動物疫病預(yù)防控制中心，山東 濟南 250022；4.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；5.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心，重慶 渝北 401120；6.浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州 310020）

豬瘟為我國的重大動物疫病。在《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年）》中，將豬瘟作為我國優(yōu)先防治和重點防范的16種動物疫病之一。我國對豬瘟防控主要采用豬瘟疫苗免疫加捕殺的策略，而抗體檢測是免疫效果評價的主要手段。目前，世界動物衛(wèi)生組織推薦的豬瘟抗體檢測方法是ELISA檢測方法和熒光抗體中和試驗Fluorescent antibody virus neutralisation test，F(xiàn)VNT）[1]，而FVNT對試驗條件和操作人員的要求很高，且耗時長，僅適合專業(yè)實驗室進行少量樣本檢測，不宜推廣應(yīng)用。因此可以說，ELISA方法是目前國際上承認的惟一適合大規(guī)模應(yīng)用的血清檢測方法。在進行ELISA檢測方法評價時，最重要的兩個指標就是敏感性和特異性，而二者又存在一定的矛盾性。當對一種檢測方法的敏感性要求較高時，勢必會損失一部分特異性；同樣，當特異性要求較高時，勢必會損失一部分敏感性。因此，對于一個好的檢測方法來說，一定要尋找敏感性和特異性最佳的平衡點和結(jié)合點[2-4]。目前，用于豬瘟抗體檢測的ELISA方法主要有液相阻斷ELISA和間接ELISA兩種原理。液相阻斷ELISA使用了單克隆抗體，因此檢測的特異性更高；而間接ELISA則更側(cè)重于敏感性。因此，為了研究豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒的臨床應(yīng)用效果，采用該試劑盒和進口阻斷試劑盒對田間采集的臨床血清樣本進行檢測，同時采用OIE推薦的FVNT進行符合驗證，幫助讀者在實際工作中選擇更為合適的檢測試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 PK15傳代細胞系、豬瘟病毒Thiveral株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存并提供。

1.1.2 豬瘟病毒單克隆熒光抗體 由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存并提供。

1.1.3 試劑盒 豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒（簡稱“間接試劑盒”）中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號為20130524。豬瘟病毒抗體檢測試劑盒（簡稱“阻斷試劑盒”）：批號為A651，購自美國IDEXX公司。

1.1.4 血清樣本 臨床血清樣本1 621份，分別采自四川省、重慶市、山東省、天津市、浙江省的種豬場、商品豬場和散養(yǎng)戶（見表1）。其中，經(jīng)豬瘟疫苗免疫豬血清1 245份，非免疫仔豬血清376份（見表2）。

表1 臨床樣本來源統(tǒng)計

表2 臨床血清樣本免疫狀況統(tǒng)計

1.2 方法

1.2.1 ELISA試劑盒檢測 采用上述兩種試劑盒分別對1 621份田間血清進行檢測，每份血清重復(fù)2孔，檢測步驟按照試劑盒說明書進行。計算兩種試劑盒的符合率，結(jié)合血清的免疫背景，對檢測結(jié)果進行分析。

1.2.2 熒光抗體病毒中和試驗 將上述兩種ELISA試劑盒檢測結(jié)果有差異的血清用FVNT進行驗證，具體操作方法參見《陸生動物診斷試劑和疫苗手冊》[1]。比較兩種試劑盒在檢測田間樣本時與FVNT的符合率。

2 結(jié)果

2.1 兩種試劑盒的檢測結(jié)果及符合率 在臨床檢測的1 621份豬血清樣本中，用間接試劑盒檢測出1 020份陽性，531份陰性，70份可疑；用阻斷試劑盒檢測916份陽性，628份陰性，77份可疑。檢測結(jié)果不相符的樣本為355份，其中有216份血清的檢測結(jié)果相反（一種試劑盒為陽性，另一種為陰性），另有139份血清的檢測結(jié)果存在可疑結(jié)果。兩種試劑盒的總符合率為78.1%（見表3）。

表3 間接試劑盒與阻斷試劑盒符合率統(tǒng)計

2.2 熒光抗體病毒中和試驗（FVNT）對兩種試劑盒檢測結(jié)果不符合血清的驗證 在上述兩種試劑盒檢測結(jié)果不符合樣本355份血清樣本中，從中選出283份足量血清，采用FVNT方法進行驗證性檢測，比較FVNT與兩種試劑盒的符合率（見表4和表5）。結(jié)果間接試劑盒與FVNT的符合率為69.26%，阻斷試劑盒與FVNT的符合率為28.62%。FVNT檢測結(jié)果代表性圖片見中插彩版圖1～4（其他血清照片略）。

圖1 Thiveral株病毒接毒對照

圖2 未接毒細胞對照

圖3 非免疫血清

圖4 免疫血清

表4 間接試劑盒與FVNT的符合率

表5 阻斷試劑盒與FVNT的符合率

中插彩版圖1為Thiveral豬豬瘟病毒接毒對照；中插彩版圖2為未豬瘟病毒細胞對照；中插彩版圖3為非免疫血清，樣本中無豬瘟病毒抗體，與豬瘟病毒Thiveral株不發(fā)生中和反應(yīng)，因此病毒能感染PK-15細胞，經(jīng)培養(yǎng)后用豬瘟病毒熒光抗體進行染色，感染細胞出現(xiàn)特異性熒光（胞漿染色）；中插彩版圖4為免疫血清，樣本中含豬瘟病毒抗體，與豬瘟病毒Thiveral株發(fā)生中和反應(yīng)，使病毒喪失了對細胞的感染能力，經(jīng)培養(yǎng)后用豬瘟病毒熒光抗體進行染色，在細胞中觀察不到特異性熒光。

2.3 間接試劑盒與阻斷試劑盒對免疫和非免疫血清的檢測結(jié)果 在1 621份臨床血清樣本中，有免疫血清1 245份，非免疫仔豬血清376份。在1 245份免疫血清中，間接試劑盒檢測出陽性1 008份，陽性率為80.96%（見表6）；阻斷試劑盒檢出陽性835份，陽性率為67.07%。在376份非免疫血清中，間接試劑盒檢出陰性323份，陰性率為85.9%；阻斷試劑盒檢出陰性296份，陰性率為78.72%（見表7）。

表6 間接試劑盒對臨床樣本檢測結(jié)果統(tǒng)計

表7 阻斷試劑盒對臨床樣本檢測結(jié)果統(tǒng)計

3 討論

豬瘟在我國屬重大動物疫病。豬瘟疫苗為強制免疫疫苗。農(nóng)業(yè)部規(guī)定，每年的春季和秋季都要集中進行免疫防疫，規(guī)模豬場和散養(yǎng)戶必須按照規(guī)定的免疫程序進行全群免疫，而對免疫抗體水平監(jiān)測是免疫效果評價的惟一手段。在農(nóng)業(yè)部頒布的2010-2013年國家動物疫病監(jiān)測方案中，規(guī)定可以采用阻斷ELISA或間接ELISA等方法進行豬瘟抗體水平檢測。因此說明，阻斷ELISA和間接ELISA在實際應(yīng)用過程中，均具有合理性。但是針對我國的大規(guī)模強制免疫現(xiàn)狀，如何在不同的應(yīng)用范圍選擇適合的試劑盒就成為一個重要問題。

3.1 試劑盒研制原理的差異 阻斷試劑盒基于液相阻斷原理[5]，反應(yīng)孔的顏色深淺與血清中的抗體含量成反比。阻斷ELISA采用了單克隆抗體檢測，可大大提高檢測的特異性，但實際檢測的對象卻只是針對單一表位的抗體。因此，當陽性血清中針對該表位抗體豐度不高時，會導(dǎo)致檢測的敏感性降低。

間接試劑盒基于間接ELISA原理[5]，反應(yīng)孔顏色深淺與結(jié)合在反應(yīng)板中的特異性抗體的量成正比。由于間接ELISA檢測的是針對包被抗原蛋白的多克隆抗體，因此會提高檢測的敏感性；但如果包被抗原的特異性或純化工藝不高，會導(dǎo)致較嚴重的非特異性反應(yīng)，影響檢測的特異性。

在進行田間大規(guī)模普查時，需要對某一地區(qū)，某一群體的整體免疫狀況進行分析，因此對檢測方法的敏感性要求較高。而針對某一規(guī)模化豬場來說，尤其是種豬場，需要對每頭動物的抗體水平進行檢測評價的同時，還要排除其他疫病陽性抗體的干擾，因此對檢測方法的特異性要求較高。因此，上述兩種ELISA檢測方法具有各自的優(yōu)勢和局限性，在實際應(yīng)用過程中，一定要對試劑盒的質(zhì)量進行嚴格的甄選，并且根據(jù)實際應(yīng)用對象選擇適當?shù)臋z測方法。

3.2 兩種試劑盒與FVNT符合率差異 熒光抗體病毒中和試驗（FVNT）是OIE推薦方法，為豬瘟抗體檢測的“金標準”。此次試驗所采用的豬瘟病毒熒光抗體為單克隆熒光抗體，引自英國AHVLA實驗室，能夠識別我國所有流行的豬瘟毒株[7]，該株熒光單抗的使用，大大的提高了FVNT方法的敏感性與特異性。本次臨床試驗對兩種ELISA抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果存在差異的283份血清樣本采用FVNT的方法進行了確認檢測，結(jié)果顯示，間接試劑盒與FVNT的符合率為69.26%，阻斷試劑盒與FVNT的符合率為28.62%。不符合樣本的確認結(jié)果表明，間接試劑盒能更真實地反映疫苗免疫后的中和抗體水平，而阻斷試劑盒對陽性血清存在明顯的漏檢狀況。

3.3 兩種試劑盒檢測結(jié)果與免疫背景之間的關(guān)系 豬瘟在田間的感染和流行情況較為復(fù)雜。在某些豬瘟流行地區(qū)，豬瘟疫苗免疫失敗的情況比較常見。因此，田間采集的免疫血清中存在陰性血清。另外，某些仔豬會可能由于感染等原因產(chǎn)生豬瘟抗體，因此非免疫仔豬血清中也會有部分陽性血清。雖然存在一些不確定因素，但總體來說，一個地區(qū)的免疫狀況基本能夠反映該地區(qū)豬群的整體免疫水平。在此次的臨床試驗中，間接試劑盒和阻斷試劑盒對免疫血清檢測的陽性率分別為80.96%和67.07%，說明在臨床的免疫血清中，確實存在一部分豬瘟抗體陰性血清；而對非免疫血清的陰性率檢測結(jié)果分別為85.9%和78.72%，說明臨床的非免疫血清中，存在陽性血清。因此對于田間采集的臨床樣本來說，如果以臨床樣本的免疫背景作為參考依據(jù)，間接試劑盒的敏感性和特異性均優(yōu)于阻斷試劑盒。

3.4 兩種試劑盒檢測結(jié)果產(chǎn)生差異的原因 在對1 621份田間樣本進行檢測時，兩種試劑盒的總符合率為78.1%，較實驗室研究結(jié)果低7.97%[6]。通過對各個地區(qū)的符合率結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，不同試驗地區(qū)的符合率存在較大差異，最高為83.67%，最低僅為71.47%。從上述結(jié)果可以看出，由于各地區(qū)免疫狀況復(fù)雜，不同地區(qū)豬群的抗體水平差異很大，導(dǎo)致臨床試驗中兩種試劑盒的符合率也存在很大差異。而實驗室研究中所檢測的血清樣本均采自生產(chǎn)狀況良好、管理規(guī)范的規(guī)模化豬場，并且所有血清均經(jīng)過FVNT方法的定性檢測，因此實驗室符合試驗用陽性血清的抗體水平相對較高，檢測結(jié)果更加容易判斷。另外，不同地區(qū)、不同實驗室人員的操作水平也是影響試劑盒符合率的一個重要原因。

4 結(jié)論

通過大量的田間試驗數(shù)據(jù)表明，在我國豬瘟疫苗強制免疫的政策下，選擇豬瘟病毒間接ELISA抗體試劑盒更適合我國實際情況。

[1]世界動物衛(wèi)生組織.陸生動物診斷試驗和疫苗手冊（哺乳動物、禽鳥與蜜蜂）[M].5版.農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局／中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，譯.2004．

[2]王駿，吳虹橋，宋兆琪，等.受試者作業(yè)特征曲線（ROC）及其在影像學(xué)中的應(yīng)用[J].放射學(xué)實踐，2000,15(3):201-202.

[3]杜雅麗，李道帆，李靜，等.用ROC曲線評價心血管病危險因素聚集的相關(guān)因素及適宜切點的確定[J].廣東醫(yī)學(xué)，1999,24(9):993-995.

[4]陳衛(wèi)中，倪宗瓚，潘曉平，等.用ROC曲線確定最佳臨界點和可疑值范圍[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，32（7）：729-731.

[5]John R.Crowther,the ELISA guide book，Humana Press[M].2001.

[6]徐璐，范學(xué)政，徐和敏，等.豬瘟抗體間接ELISA檢測試劑盒的研制和應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48(9):21-24.

[7]Zhu Y，Shi Z，Drew T W，et al.Antigenic differentiation of classical swine fever viruses in China by monoclonal antibodies[J].Virus Res，2009，42（1-2）:169-174.