鴨疫里默氏菌OmpA與鴨IL-2融合基因的克隆與原核表達(dá)

高云航，劉佳麗，王 巍，李秋菊，張福君，馬紅霞

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林正方農(nóng)牧股份有限公司，吉林 梅河 135000）

鴨疫里默氏菌（RA）是一種革蘭陰性短小桿菌。該菌引起的疾病稱鴨傳染性漿膜炎（Infectious serositis of duck）是家鴨、鵝、火雞等多種家禽和野禽的一種急性或慢性傳染病。其病理特征主要是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎以及干酪性輸卵管炎、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎等。本病雛鴨較為敏感，往往引起雛鴨生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，惡劣的飼養(yǎng)環(huán)境可以促發(fā)本病感染。發(fā)病率與死亡率均較高，慢性耐過鴨主要表現(xiàn)神經(jīng)性癥狀，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。OmpA蛋白族是革蘭陰性菌外膜的主要成分且較為保守[1]，提純的外膜蛋白和表達(dá)的外膜蛋白具有良好的抗原性[2-7]。OmpA同樣為各血清型RA所共有的結(jié)構(gòu)，在不同的血清型之間存在著差異，但這種差異不足以影響蛋白質(zhì)的抗原特性[8]，因此可以作為保護(hù)多種血清型RA的亞單位疫苗的候選。白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）是輔助性T細(xì)胞和NK細(xì)胞受絲裂原或抗原刺激后產(chǎn)生的一種重要細(xì)胞因子，是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中的核心物質(zhì)之一，目前，已有應(yīng)用IL-2的基因工程苗預(yù)防雞、鵝傳染病的相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于IL-2的基因工程疫苗在鴨病中的應(yīng)用的報(bào)道較少。

本試驗(yàn)為了提高RA基因工程疫苗免疫效果，將RA OmpA基因與從健康鴨外周血淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出的DuIL-2基因，兩段基因以一段柔性linker相連，利用SOE-PCR技術(shù)，構(gòu)建OmpA-DuIL-2融合基因，并進(jìn)行了原核表達(dá)，經(jīng)Western-blot分析，表達(dá)出的融合蛋白同時(shí)具有OmpA和DuIL-2的免疫原性，并為進(jìn)一步開發(fā)和研制新型RA基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和載體 大腸桿菌Rosetta（DE3），購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-28a表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD-JL-RA1-OmpA、pMD-DuIL-2重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑 IPTG、卡那霉素、SDS、30%丙烯酰胺（29∶1）、Tris、TEMED、NC膜，購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；中分子量預(yù)染蛋白Marker、DAB顯色試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；抗鴨IL-2單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鴨IgG、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，購自美國(guó)KPL公司。

1.3 試驗(yàn)引物設(shè)計(jì) 根據(jù)吉林分離株JL-RA1 OmpA（登錄號(hào)HQ707077）設(shè)計(jì)特異性引物P1和P2，上游引入BamH I酶切位點(diǎn)，下游引入一段互補(bǔ)的linker。DuIL-2成熟片段基因序列（登錄號(hào)AY193713）設(shè)計(jì)特異性引物P3和P4，上游引入另一段互補(bǔ)的linker，下游引入Hind III酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 OmpA-linker、linker-DuIL-2基因的擴(kuò)增與純化OmpA-linker PCR反應(yīng)體系：pMD-JL-RA1-OmpA 0.5 μL，OmpA-P1 0.5 μL，OmpA-P2 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2.0 μL，10×Pyrobest Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，Pyrobest DNA聚合酶（5 U/μL）0.15 μL，ddH2O 18.85 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，51℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

linker-DuIL-2 PCR反應(yīng)體系：pMD-DuIL-2 0.5 μL，DuIL-2-P3 0.5 μL，DuIL-2-P4 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2.0 μL，10×Pyrobest Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，Pyrobest DNA聚合酶（5 U/μl）0.15 μL，ddH2O 18.85 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，51℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

PCR產(chǎn)物回收按照Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 克隆載體pMD-OmpA-DuIL-2融合質(zhì)粒的構(gòu)建

1.5.1 SOE-PCR擴(kuò)增OmpA-DuIL-2融合基因OmpA-DuIL-2融合基因PCR反應(yīng)體系：linker-DuIL-2回收產(chǎn)物0.3 μL，OmpA-linker回收產(chǎn)物0.7 μL，OmpA-P1 0.5 μL，DuIL-2-P4 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2.0 μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，Ex Taq（5 U/μl）0.3 μL，ddH2O 18.2 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.5.2 pMD18-OmpA-DuIL-2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將分離株分別按照Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒說明書和pMD-18T Simple Vector說明書將進(jìn)行操作。并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH-5α，涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，并將陽性菌株用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切重組質(zhì)粒的鑒定。

1.6 原核表達(dá)載體pET-28a-OmpA-DuIL-2的制備 將重組質(zhì)粒pMD18-OmpA-DuIL-2和表達(dá)載體pET-28a分別以BamH I和Hind III雙酶切，OmpA-DuIL-2基因片段與pET-28a連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，用BamH I和Hind III雙酶切鑒定、PCR鑒定。陽性質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.7 重組融合質(zhì)粒pET-28a-OmpA-DuIL-2的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確重組質(zhì)粒pET-28a-OmpADuIL-2轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta（DE3），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.7～0.8時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，取誘導(dǎo)后5 h菌液及空載體誘導(dǎo)5 h菌液，離心收集菌體，按比例加入一定量TE緩沖溶液懸浮菌體，超聲破碎儀裂解菌體10 min，革蘭染色檢測(cè)菌體裂解程度，有80%以上的菌體裂解后，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物Western-blot檢測(cè) 誘導(dǎo)表達(dá)5 h的融合菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以RA陽性血清和鴨IL-2單克隆抗體分別為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗鴨IgG、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體為二抗，聯(lián)苯胺（DAB）為底物，進(jìn)行Western-blot分析。

2 結(jié)果

2.1 OmpA-linker、linker-DuIL-2基因的擴(kuò)增序列擴(kuò)增結(jié)果 OmpA-linker基因PCR結(jié)果顯示，僅有一條目的條帶，大小約為1 182 bp，且無引物二聚體條帶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)計(jì)目的片段大小相符；linker-DuIL-2基因PCR結(jié)果顯示，得到了大小約為381 bp的特異性DNA片段，與預(yù)期的目的片段的大小一致，見圖1。

2.2 OmpA-DuIL-2融合基因的克隆結(jié)果 運(yùn)用SOE-PCR技術(shù)，以O(shè)mpA-P1和DuIL-2-P4，為一對(duì)引物，構(gòu)建OmpA-DuIL-2融合基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到了大小約為1 551 bp的特異性DNA片段，與預(yù)期的目的片段的大小一致，見圖2。

2.3 重組融合表達(dá)載體PCR和酶切鑒定結(jié)果pET-OmpA-DuIL-2陽性質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定及BamH I、Hind III雙酶切鑒定，均得到了片段大小約為1 551 bp，結(jié)果表明，該融合基因已經(jīng)連接到表達(dá)載體pET-28a上，見圖3。

2.4 重組融合質(zhì)粒pET-OmpA-DuIL-2基因序列測(cè)定 陽性重組質(zhì)粒pET-OmpA-DuIL-2送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果與擴(kuò)增出OmpA和DuIL-2基因序列比對(duì)結(jié)果完全一致，沒有出現(xiàn)移位、缺失、突變及錯(cuò)配現(xiàn)象。

2.5 重組融合表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果 融合基因誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，在 OD600≈0.6～0.7，IPTG 終濃度為 1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)5 h，誘導(dǎo)菌經(jīng)超聲波破碎，檢測(cè)上清液和菌體沉淀中的蛋白含量，結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白主要以包涵體的形式存在，存在于沉淀中。重組融合蛋白的分子量大小約為61 kDa，見圖4。

2.6 Western-blot檢測(cè)結(jié)果 以鴨疫里默氏菌陽性血清，鑒定OmpA表達(dá)情況，以抗鴨IL-2單克隆抗體鑒定DuIL-2的表達(dá)情況，結(jié)果表明，構(gòu)建的重組融合蛋白OmpA（圖5）和DuIL-2（圖6）均具有反應(yīng)原性。

3 討論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短、成本低廉等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。而pET系統(tǒng)是大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的首選。本試驗(yàn)以pET-28a為表達(dá)載體，但OmpA-DuIL-2在大腸桿菌BL21中并沒有表達(dá)，推測(cè)可能與該段序列中含有較多大腸桿菌稀有密碼子有關(guān)。本試驗(yàn)將表達(dá)菌株大腸桿菌BL21換成具有可以補(bǔ)充大腸桿菌稀有密碼子Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，融合基因得到表達(dá)。

目前，已有不少學(xué)者對(duì)RA的表面免疫蛋白進(jìn)行了研究，并認(rèn)為OmpA基因是所有血清型的RA所共有的結(jié)構(gòu)基因，盡管其機(jī)理尚未完全清楚，但周祖濤[9]等用PCR方法擴(kuò)增了血清1型RAYM株的主要外膜蛋白OmpA基因，并構(gòu)建了原核表達(dá)載體pKG-OmpA，在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，融合蛋白大小約為68 kDa，Western-blot結(jié)果表明該表達(dá)蛋白具有良好的免疫原性。IL-2能有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，是世界公認(rèn)的機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中的核心物質(zhì)之一，因此，IL-2是保障機(jī)體正常免疫功能的重要因素。IL-2具有一定的種屬特異性，家禽的IL-2不能作用于人和其他哺乳動(dòng)物。目前，已有應(yīng)用IL-2的基因工程苗預(yù)防雞、鵝傳染病的相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于IL-2的基因工程疫苗在鴨病中的應(yīng)用的報(bào)道較少。張欣[13]等成功的擴(kuò)增出廣州白鴨IL-2成熟蛋白基因，并進(jìn)行了原核表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，蛋白分子量大小約為33 kDa，具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的活性。說明，鴨IL-2能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功大量表達(dá)，但鮮有鴨IL-2在免疫增強(qiáng)劑方面作用的報(bào)道。

為提高鴨疫里默氏菌疫苗的免疫保護(hù)力，本試驗(yàn)將IL-2應(yīng)用于RA的OmpA基因工程疫苗中。將RA OmpA基因與DuIL-2基因融合，OmpA去掉終止密碼子TAA，加入一段由12個(gè)氨基酸組成的柔性linker，連接DuIL-2基因，組成OmpADuIL-2融合基因。經(jīng)SDS-PAGE分析，融合蛋白加上His標(biāo)簽分子量大小約為61 kDa，融合蛋白主要以包涵體形式存在。為證明組成的融合蛋白否能影響RA外膜蛋白的免疫原性和鴨IL-2的活性，本試驗(yàn)分別用鴨疫里默氏菌陽性血清和抗鴨IL-2單克隆抗體為Western-blot的一抗，經(jīng)Western-blot分析結(jié)果表明，OmpA基因和鴨IL-2基因融合基因表達(dá)的產(chǎn)物具有較好的外膜蛋白抗原性和鴨IL-2免疫原性。但是本研究中OmpA-DuIL-2融合基因的表達(dá)量偏低，推測(cè)可能與該融合基因含多量大腸桿菌稀有密碼子Rosetta有關(guān)，這就需要進(jìn)一步探索提高其表達(dá)量的方法。

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