小鵝瘟與煙曲霉性肺炎混合感染的診斷

張 雙，柏亞鐸，胡桂學(xué)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽(yáng) 100026）

1 發(fā)病情況

吉林省舒蘭縣兩家養(yǎng)殖戶分別飼養(yǎng)2 000羽和1 200羽10日齡雛鵝，在2013年6月份，相繼死亡300羽和200羽，死亡率高達(dá)20%。此前，該鵝場(chǎng)未曾有過相關(guān)疫情。該兩家養(yǎng)殖戶均通過炕房孵育，在出殼后注射小鵝瘟高免血清，7 d后沒有注射小鵝瘟疫苗。由于2013年6月份雨季下雨比較多，導(dǎo)致飼料和墊料都比較潮濕，飼料結(jié)塊，墊料有明顯的發(fā)霉味。隨后，兩家養(yǎng)殖戶將10羽10日齡的患病鵝送至本實(shí)驗(yàn)室診斷。

2 臨床癥狀

病鵝精神沉郁，羽毛松亂，食欲不振，飲欲增加，垂頭縮頸，走路緩慢，排灰白或淡黃綠色稀糞，便中帶有纖維狀碎片和氣泡。病鵝離群，發(fā)育遲緩，漸進(jìn)性消瘦，站立不穩(wěn)，隨著病情的發(fā)展，患病雛鵝呼吸困難，呼吸頻率加快，但沒有發(fā)出明顯的啰音。

3 病理剖檢

病鵝的病變部位主要位于空腸和回腸，呈現(xiàn)卡他性纖維素性壞死性腸炎，腸道出現(xiàn)明顯的充血、腫脹、腸黏膜壞死、脫落，內(nèi)容物形成栓塞，類似于香腸（見中插彩版圖1），在肺臟和氣囊上有針尖或粟粒狀白色或黃色結(jié)節(jié)（見中插彩版圖2），切開后有黃白色干酪樣滲出物。

4 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

4.1 光學(xué)顯微鏡觀察 取病鵝的肺部結(jié)節(jié)，涂片，滴加兩滴10%KOH溶液(1.000 g加入10 mL的蒸餾水中)，在顯微鏡下觀察，可見大量的菌絲和孢子（見中插彩版圖3）。

4.2 細(xì)菌分離與鑒定 將病鵝肺臟病料進(jìn)行劃線培養(yǎng)，接種于固體沙堡勞培養(yǎng)基，置于30℃，培養(yǎng)12 h后觀察，結(jié)果（見中插彩版圖4），挑取單一菌落接種于液體沙堡勞培養(yǎng)基，180 r/min，（28℃），振蕩培養(yǎng)12 h。

圖1 腸道內(nèi)容物栓塞如箭頭所示

圖2 氣囊上的白色結(jié)節(jié)

圖3 真菌鏡檢結(jié)果

圖4 細(xì)菌分離結(jié)果

參照寶生物工程（大連）有限公司的TaKaRa試劑盒操作說明書，提取培養(yǎng)菌的DNA，稀釋100倍做為模板，引物參照李建俠等（2011）設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：

上游引物ITS1-F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′；

下游引物ITS2-R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′。

反應(yīng)體系如表1：

表1 PCR鑒定煙曲霉菌反應(yīng)體系

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR擴(kuò)增片段的大小。

5 病毒學(xué)檢測(cè)

5.1 病毒分離培養(yǎng) 無(wú)菌采取疑似感染小鵝瘟病毒雛鵝的肝臟進(jìn)行研磨，按1∶5的比例加入3 mL生理鹽水，5 000 r/min（4℃）離心 5 min，取上清，反復(fù)凍融3次，加入1%的雙抗至最終濃度為1 000 IU/mL，置于37℃感作30 min，接種于4枚11日齡的非免疫鵝胚，每枚鵝胚接種0.2 mL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組為2枚鵝胚，分別接種0.2 mL的生理鹽水，置于37℃孵化。每隔6 h觀察一次，棄去在24 h內(nèi)死亡的鵝胚，收獲24 h至96 h死亡鵝胚的尿囊液。

5.2 病毒的鑒定 將收獲的尿囊液稀釋100倍作為模版，引物參照胡桂學(xué)等（2003）[2]，設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：

GPV-F：CCAAGCTACAACAACCACATCTAC；

GPV-R：CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC

反應(yīng)體系如表2。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳，觀察PCR擴(kuò)增片段的大小。

表2 PCR鑒定鵝細(xì)小病毒（GPV）的反應(yīng)體系

6 結(jié)果

PCR結(jié)果:經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析其目的片段為375 bp，鑒定為小鵝瘟病毒；PCR結(jié)果:經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，其目的片段為264 bp鑒定為煙曲霉。見圖5、6。

7 討論

通過對(duì)舒蘭縣兩家鵝場(chǎng)的發(fā)病情況、臨床癥狀及病例剖檢等觀察，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷，確診該病鵝為鵝細(xì)小病毒與煙曲霉菌性肺炎的混合感染。

鵝細(xì)小病毒主要是感染3～30日齡的雛鵝，主要在5～20日齡內(nèi)發(fā)病，30日齡以上的雛鵝不易發(fā)病，所以小鵝瘟主要是呈周期性流行。煙曲霉易發(fā)生于春季，由于雨水比較多，氣候潮濕，導(dǎo)致家禽的飼料和墊料潮濕，再加溫度，酸堿度等原因，使其大量發(fā)霉，而鵝通過呼吸進(jìn)食等吸入大量的真菌孢子，感染發(fā)病。

病例通過發(fā)病情況，臨床癥狀，病例剖檢及PCR檢測(cè)，鑒定為為鵝細(xì)小病毒與煙曲霉性肺炎的混合感染。初步推測(cè)由于吉林省舒蘭縣養(yǎng)殖戶管理飼養(yǎng)等不當(dāng)，在雛鵝剛出殼后感染小鵝瘟病毒，由于5、6月份雨季下雨比較多，養(yǎng)殖舍及飼料等潮濕，使雛鵝繼發(fā)生霉菌的混合感染。

由于鵝細(xì)小病毒是垂直傳播，所以應(yīng)對(duì)母鵝進(jìn)行免疫接種，在母鵝產(chǎn)前15～30日齡和產(chǎn)后的15～20日齡應(yīng)分別注射小鵝瘟病毒疫苗，每羽1 mL。母鵝在產(chǎn)后3～10周內(nèi)產(chǎn)蛋和所孵雛鵝對(duì)小鵝瘟具有免疫力。對(duì)于發(fā)病鵝群應(yīng)及時(shí)接種小鵝瘟高免血清，發(fā)病鵝每只注射1.5 mL，有較好治療效果。煙曲霉對(duì)于制霉菌素具有一定的敏感性，應(yīng)及時(shí)對(duì)健康鵝進(jìn)行口服預(yù)防，防止其產(chǎn)生混合感染。

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格進(jìn)行消毒，在種蛋入孵前，對(duì)種蛋及孵化室、所有器具用福爾馬林或復(fù)合粉進(jìn)行消毒，禁止使用霉變的飼料，及時(shí)降低飼料的堆放密度，加強(qiáng)通風(fēng)，防止舍內(nèi)過于潮濕，平時(shí)一定注意環(huán)境衛(wèi)生及防疫。

[1]李建俠，刁有祥，國(guó)紀(jì)磊，等.肉鴨煙曲霉菌的分離與鑒定[J].中國(guó)家禽，2011，33（18）:56-57.

[2]胡桂學(xué)，逄博，高鳳山，等.小鵝瘟PCR診斷方法的建立和初步應(yīng)用[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2003，7（2）:50-53.