中藥成分對新城疫強毒感染DF1能力的影響

劉 坤，鄒海濤，李燕榮，李云崗，劉家國，姜 平，蘭鄒然

（1.南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2.山東省動物疫病預防與控制中心，山東 濟南 250022）

雞新城疫是由新城疫病毒（NDV）引起的一種急性高度接觸性傳染病，發病率和病死率高，對養禽業危害大。到目前為止治療病毒病還缺乏特效方法。接種疫苗是最普遍的預防措施，但是很難全面控制這類疫病。近年來，研究證實許多中草藥以及其主要成分都具有抗病毒活性[1]，本試驗測定了黃芩苷和氧化苦參堿等10種中藥成分對新城疫強毒感染雞胚成纖維細胞（DFI）能力的影響，為篩選出具有較強抗病毒作用的中藥成分復方提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物和病毒 黃芩苷、三七總皂苷、氧化苦參堿、黃連小檗堿、菊花總黃酮、綠原酸、黃芪多糖、板藍根多糖、板藍根生物堿和淫羊藿多糖中藥提取物，購自西安普萊特生物工程公司；NDV F48E8株，山東省家禽研究所惠贈。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM高糖細胞培養液；胎牛血清；MTT粉末；胰蛋白酶-EDTA；CO2培養箱；倒置顯微鏡；酶標儀；電子天平。

1.3 試驗方法

1.3.1 將各中藥成分用2%細胞維持液配制成含量為5 mg/mL的液體，過濾除菌，倍比稀釋進行預試驗測定藥物的最大安全質量濃度[2]（氧化苦參堿、板藍根生物堿、板藍根多糖，2 500 μg/mL；金銀花提取物、三七總皂苷，80 μg/mL；黃芪多糖，600 μg/mL；黃芩苷，150 μg/mL；黃連小檗堿，1 250 μg/mL；菊花總黃酮、淫羊藿多糖，300 μg/mL）。臨用前將其作為最大濃度1，然后進行倍比稀釋成2、3、4、5種濃度。

1.3.2 將病毒接種于單層雞胚成纖維細胞（DF1），37℃5%CO2恒溫培養，48 h收取細胞毒，按Reed-Muench法[3]測定TCID50，用細胞維持液配成100 TCID50濃度備用。

1.3.3.1 將已經長成致密單層的DF1用胰酶消化，將細胞數調整至5×105個/mL后加入到96孔細胞板中，每孔100 μL，37 ℃ 5%CO2條件下培養，待細胞長成單層后進行試驗。試驗組分別以3種方式[5]加入各質量濃度的中藥成分和NDV，每種濃度的中藥成分設4孔重復，同時設病毒與細胞對照組。（1）先加中藥成分后接種NDV：每孔加入100 μL不同質量濃度的中藥成分，培養2 h后棄掉孔內液體，再加入100 μL NDV；（2）先接種NDV后加中藥成分：方法同上，順序相反；（3）NDV和中藥成分感作后同時加：4℃感作2 h后加入到DF1中，每孔100 μL。

1.3.4 細胞活性測定 37℃5%CO2培養箱中培養44 h后，每孔加入30 μL MTT溶液，放入培養箱繼續培養4 h，倒掉孔內液體，加入100 μL DMSO，用微量振蕩器震蕩10 min后，用酶標儀測定OD570值作為衡量指標。

1.3.5 數據分析與處理 用SPSS軟件對各組數據進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 先加中藥后加病毒 從表1可以看出，黃芩苷在9.375～150 μg/mL，黃芪多糖在37.5～300 μg/mL，菊花總黃酮和淫羊藿多糖在18.75～300 μg/mL，氧化苦參堿在156.25～1250 μg/mL，三七總皂苷在5～40 μg/mL，板藍根多糖和板藍根生物堿在156.25～1250 μg/mL濃度范圍內，均能抑制病毒感染細胞，而綠原酸和黃連小檗堿效果不明顯。

表1 先加中藥時10種中藥成分的OD570值

2.2 先加病毒后加中藥 從表2可以看出，黃芩苷在9.375～150 μg/mL，黃芪多糖在37.5～300 μg/mL，菊花總黃酮在18.75～300 μg/mL，氧化苦參堿在156.25～1 250 μg/mL，板藍根多糖和板藍根生物堿均在156.25～1 250 μg/mL，三七總皂苷在5～20 μg/mL，淫羊藿多糖在18.75 μg/mL，有抑制病毒的作用。而綠原酸和黃連小檗堿則無抗病毒效果。

2.3 中藥和病毒感作后同時加入 從表3可以看出，黃芩苷在9.375～150 μg/mL，菊花總黃酮在18.75～300 μg/mL，氧化苦參堿在156.25～2 500 μg/mL，三七總皂苷在5～40 μg/mL，黃芪多糖在37.5～300 μg/mL，板藍根多糖和板藍根生物堿在156.25～1 250 μg/mL，黃連小檗堿在156.25～312.5 μg/mL，淫羊藿多糖在37.5 μg/mL能夠抑制病毒感染細胞，而綠原酸無效果。

3 討論

近年來，很多研究已經證實，許多中草藥以及其成分具有抗病毒活性，并用于抗病毒和細菌感染[5]。本試驗通過三種不同方式將NDV和中藥成分加入到DF1中，充分作用后用MTT法測定細胞的OD570值作為中藥對病毒抑制作用的衡量指標。當試驗組的OD值顯著高于病毒對照組時，表明藥物在適當的濃度范圍內能夠抑制病毒的感染。從試驗結果可以看出，黃芩苷、三七總皂苷、黃芪多糖、板藍根多糖、板藍根生物堿、氧化苦參堿、菊花總黃酮這7種藥物無論哪種加藥方式，均能夠對病毒產生抑制作用，淫羊藿多糖在先于病毒加入時效果明顯，綠原酸在與病毒感作后有較弱的抗病毒效果，而黃連小檗堿對NDV不產生抑制效果。此次試驗的結果與邢玉娟[6]等人研究相似。但試驗中中藥的最大安全濃度以及OD值與先前報道的數值[3]有些不同，或許與中藥成分的質量以及細胞不同有關。

從給藥方式來看，總體上，先加中藥后加病毒對抑制病毒感染的能力較其他兩種方式要強。不同藥物濃度對抑制病毒的能力也有一定影響，如黃芩苷和菊花總黃酮在高濃度時對病毒的抑制效果要強于低濃度時，而三七總皂苷和氧化苦參堿這兩種中藥成分則在較低濃度時對病毒的抑制作用較強。因此，在選取中藥要同時考慮以上兩因素，才能發揮中藥的最佳抗病毒效果。

表2 先加病毒時10種中藥成分的OD570值

表3 中藥病毒感作后10種中藥成分的OD570值

在治療病毒病方面，一些細胞因子雖然能夠抑制病毒復制，但是由于成本高，所以仍然停留在實驗室研究或者臨床試驗階段。此外，雖然還有一些化學合成的抗病毒藥物在臨床上使用，但其臨床效果也不盡人意，并存在藥物殘留等不利因素。鑒于目前我國對病毒病防治存在一定困難，中藥在治療病毒病方面的應用具有不錯的前景。通過此次試驗，篩選出抗病毒效果較好的單藥成分，為組成中藥組方，發揮協同效應，使中藥達到抑制病毒的最佳效果奠定了堅實的基礎。

[1]Ji Y B.Chemistry and Pharmacology of Chinese Herbal Medicine Compound People’s Health Press[J].Beijing，2003，Suppl.pp.18-35.

[2]劉家國，陳玉庫，胡元亮，等.幾種天然藥物成分在體外CEF中最大安全濃度的測定[J].動物醫學進展，2002，23（3）：88-91.

[3]殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997：204-246.

[4]李德勝，胡元亮，索珍，等.12種藏藥對新城疫病毒感染雞胚成纖維細胞能力的影響[J].中國獸醫學報，2008，28（9）：1061-1064.

[5]Schnitzler P，Schuhmacher A，Reichling J.Virucidal effect of peppermint oil on the enveloped viruses herpes simplex virus type 1 and type 2 in vitro[J].Phytomedicine，2003，504-510.

[6]邢玉娟，陳玉庫，胡元亮，等.7種中藥成分對新城疫病毒感染雞胚成纖維細胞能力的影響[J].中國獸醫雜志，2011，47（9）:46-48.