4-芐氧基苯酚與鯡魚精DNA相互作用的研究*

胡亞敏，魯俊良，王興明，楊 歡

(西南科技大學材料科學與工程學院化學系，四川綿陽 621010）

天然酚類化合物是動植物體內最為豐富的次生代謝產物之一［1］，這些酚類化合物均具有很好的生物活性。酚類化合物由于其螯合特性，被證實了具有抗炎癥、抗變態反應、抗病毒以及抗癌癥等特性［2－5］。許多酚類或者酚類衍生物都具有很強的抗氧化能力而對人體健康起著非常重要的作用，如葡萄酒、茶、咖啡等等中的酚類化合物。酚類化合物結構中由于含有一個或者多個酚性羥基而很強的抗氧化能力以及自由基清除的能力，所以酚類化合物都具有獨特的藥理活性以及生理功能，對于疾病的預防與治療都起著非常積極的作用，正是因為如此，酚類化合物引起了許多研究者的興趣［6－9］。目前，由于DNA以及多酚類化合物及酚類衍生物結構的復雜多變性，人們對于酚類化合物抗腫瘤細胞的作用機制還未完全地建立起比較完整的理論，仍需進一步深入研究。4-芐氧基苯酚又叫莫諾苯宗、氫醌芐基醚、對芐氧基苯酚，在工業及精細化工中有著重要用途，在橡膠工業中用作抗氧劑，也是合成選擇性雌激素受體調節劑 (SERM)阿左昔芬的重要中間體。酚羥基具有較強的自由基清除功能，而如今的研究表明抗腫瘤機制中也包含了自由基清除作用［10］，本文選擇4-芐氧基苯酚 (PBP)來研究其與鯡魚精DNA的相互作用，以便為篩選新的抗腫瘤藥物提供一定的依據和參考。4-芐氧基苯酚結構如圖1。

圖1 4-芐氧基苯酚結構圖Fig.1 Structure of 4-Benzyloxyphenol

1 實驗

1.1 試劑與儀器

F-4500型熒光光譜儀，日本日立公司;烏式貝德黏度計，上海市青浦縣前明玻璃儀器廠;pHS-2C型酸度計，成都方舟科技開發公司;HH-601超級恒溫水浴，金壇金南儀器廠。

鯡魚精DNA(hsDNA，AR，Sigma公司);溴化乙錠 (EB，AR，Sino-American biotec公司產品);三羥甲基氨基甲烷 (Tris，AR，天津科密歐化學試劑開發中心);寡聚核苷酸 (堿基序列為5'-AATCTCTCGG-3'，大連寶生物工程有限公司);其它試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜法 所有樣品均先用配制好的Tris-HCl緩沖液 (pH=7.4)溶解配制成高濃度溶液搖勻并靜置，當要使用時再稀釋成所需濃度。在熒光滴定中精確量取3.00 mL待測定溶液加入到光程為1 cm的石英比色皿中，使用注射針每次加入10 μL溶液，因加入體積很小，故可以忽略體積效應對熒光光譜的影響，測定記錄每次滴定后溶液的熒光光譜，在實驗中，發射光譜的掃描狹縫均為5 nm，掃描間隔均為1 nm，所有實驗的激發波長均為λex=441 nm。

Scatchard法:配制一系列不同比例的小分子與DNA混合液，其中DNA的濃度是固定的，每次比例為 Rt(Rt= ［小分子］/［DNA］，Rt=0，0.4，0.8，1.2)，使用熒光探針EB分別滴定上述溶液并記錄熒光光譜變化。

1.2.2 黏度法 使用烏氏貝德黏度計進行黏度法測量研究，室溫下，將配制好的DNA溶液加入到干燥好了的黏度計中，將黏度計垂直的固定好并浸泡在水溶液以保持溫度的恒定，記錄DNA流下的時間，保持DNA濃度不變，每次用小分子滴定后，待溶液混合均勻后記錄好溶液流下的時間，每次平行測量3次，取其平均值，發現溶液流下時間均大于180 s。以η/η0為縱坐標，小分子濃度為橫坐標作黏度變化圖，η為混合溶液相對黏度值，η0為DNA的相對黏度值。

2 結果討論

2.1 4-芐氧基苯酚與DNA的相互作用

在pH=7.4的模擬生理環境下，保持PBP濃度不變，向PBP溶液中滴加DNA溶液，記錄PBP的熒光光譜變化，如圖2所示。由圖知，當激發波長為441 nm時，PBP的特征發射熒光峰為584 nm，隨著溶液中鯡魚精DNA濃度的不斷增加，584 nm處峰值強度明顯減弱，同時在553 nm處出現了熒光等色點，等色點的出現說明形成了一種新的復合物。這些現象說明PBP與DNA發生了作用，并形成了新的復合物。一般，當小分子與鯡魚精DNA相互作用時熒光出現明顯猝滅或者紅移現象，則小分子與鯡魚精DNA很有可能存在嵌插作用［11］。為了得知PBP與鯡魚精DNA結合比例，在584 nm處測定的熒光值變化作摩爾比圖，如圖3，由圖得出PBP與鯡魚精DNA的結合比為nDNA∶nPBP=1∶2。

圖2 DNA對PBP熒光光譜的影響Fig.2 Fluorescence spectra of PBP with different concentrations of DNA

圖3 PBP對DNA的摩爾比圖Fig.3 Mole ratio plots of DNA-PBP

2.2 PBP與DNA之間相互作用的熱力學研究

利用熱力學研究可以了解PBP與鯡魚精DNA之間能否自發相互作用以及它們之間的作用強度。通過熱力學研究先計算出在不同溫度下的結合常數K，再計算得出各種熱力學函數值。用鯡魚精DNA滴定PBP溶液，記錄584 nm處的熒光強度變化，以1/(A0－A)為y軸，1/［DNA］為x軸作圖的雙倒數曲線圖，如圖4。由圖中可以看出，兩條曲線均有良好的線性關系，根據公式:

圖4 雙倒數曲線圖Fig.4 Double reciprocal plots

2.3 EB探針法研究PBP與DNA之間的相互作用

EB是一種常見的陽離子天然熒光染料，它是一個共軛平面分子，EB能強烈而專一的嵌入到DNA雙螺旋結構的堿基對中并且發生的經典嵌插作用，使得熒光強度增加，所以，EB是一種常用的探測DNA構象的熒光探針，廣泛應用于篩選抗腫瘤藥物以及小分子與DNA間相互作用的研究［12－14］。若是DNA分子的構象發生變化時，EB將從DNA分子中游離出來，進而引起熒光猝滅。當小分子與EB-DNA作用時，可以觀察EB-DNA的熒光變化可以判別小分子是否與DNA發生了作用以及它們之間是以何種模式發生的作用［15］，在溶液環境不變的條件下，若是熒光值降低了，說明EB被PBP擠出來了，則說明PBP此時嵌入到了DNA堿基對中。實驗時，向在EB-DNA體系滴定一定濃度的PBP溶液，記錄觀察EB-DNA熒光光譜變化，熒光光譜變化如圖5所示。隨著PBP的不斷加入，EB-DNA在603 nm處的熒光強度逐漸小幅度下降，這表明有部分PBP嵌入到DNA堿基對，同時將EB-DNA體系中的部分EB擠出，說明PBP與DNA作用與EB同DNA作用存在競爭關系，所以我們可以推斷出PBP與DNA之間存在嵌插作用。

圖5 PBP對EB-DNA體系的熒光光譜影響Fig.5 Effects of PBP on fluorescence spectra of DNA-EB

2.4 磷酸鹽與PBP之間相互作用的研究

磷酸鹽與PBP的相互作用研究是為了探究PBP與DNA之間是否存在靜電作用。本文使用Na3PO4溶液來研究磷酸鹽與PBP之間的作用模式，Na3PO4電離出的離子能很好的模擬DNA分子的磷酸骨架，若是PBP與離子發生作用而致使熒光光譜發生變化，則PBP肯定將會與DNA分子磷酸骨架發生作用，而PBP與磷酸骨架只能通過靜電作用模式結合。在PBP溶液中逐漸滴定一定濃度的Na3PO4溶液，記錄觀察PBP熒光光譜變化如圖6。隨著Na3PO4溶液濃度的不斷增加，熒光光譜顯示在584 nm PBP的特征熒光峰不斷降低，這說明PBP與離子發生了作用而致使熒光光譜降低，當PBP以靜電作用模式與離子發生作用時，PBP中的質子發生轉移而被束縛，進而使得熒光發射波長強度降低。所以PBP也將與磷酸骨架結合，這也就是說，PBP與DNA之間存在靜電作用。

圖6 磷酸鹽對PBP熒光光譜的影響Fig.6 Fluorescence spectra of PBP with different concentration of phosphate

2.5 寡聚核苷酸與PBP之間相互作用的研究

為了對PBP與DNA之間作用機制更進一步的了解，本文研究寡聚核苷酸與PBP之間的相互作用，寡聚核苷酸是只有20個以下堿基的短鏈的核苷酸，因其很容易與它們的互補鏈對結，所以經常用作探針研究DNA結構。因為寡聚核苷酸只有較短的堿基鏈而無磷酸骨架以及堿基對，固PBP只能以溝渠作用方式與寡聚核苷酸作用。固定PBP溶液濃度不變，逐漸加入寡聚核苷酸溶液，記錄觀察熒光光譜變化如圖7所示。可以看出，圖中熒光值幾乎沒有發生變化，考慮到誤差，認為在PBP溶液中加入寡聚核苷酸不會引起PBP的熒光光譜發生變化，這也就是說，PBP不會寡聚核苷酸發生作用，所以PBP也不會以溝渠作用模式與DNA發生作用。

圖7 寡聚核苷酸對PBP熒光光譜的影響Fig.7 Fluorescence spectra of PBP with different concentration of oligodeoxynucleotides

2.6 Scatchard法研究 PBP與 DNA之間的相互作用

通過小分子PBP存在下EB和DNA作用的Scatchard法分析，可以進一步判斷證實小分子與DNA之間的相互作用方式。在EB-DNA體系中滴加PBP溶液，記錄熒光強度變化并作出Scatchard圖，如圖8。

圖8 0.1mol/L與0.5mol/L時DNA-EB體系的Scatchard圖Fig.8 Scatchard plots of EB-DNA system

在依據 Scatchard方程［16］能夠計算出 PBP與DNA的作用位點n以及內在結合常數K，計算結果均列于表1中。從不同PBP濃度下的n值和K值得變化情況就可以大體分析得出PBP與DNA之間的作用方式，若n值不變那么小分子與DNA之間是經典嵌插模式，若K值不變那么小分子與DNA之間是非嵌插作用模式，若n值和K值都在變化，則小分子與DNA之間是以混合模式作用即既存在嵌插方式又存在著非嵌插作用方式。從表中得知n值和K值都在發生變化，這說明PBP與DNA之間為混合作用模式。

表1 PBP與DNA相互作用的Scatchard方程Table 1 Scatchard Equation of interaction between PBP and DNA

為了更進一步了解是哪種非嵌插作用模式存在于PBP與DNA作用中，不同濃度的強電解質NaCl被用于Scatchard分析中而平行進行兩次實驗。NaCl中的Na正離子將會在DNA分子周圍形成離子氛而包圍DNA分子，若PBP與DNA之間存在著靜電作用，那么NaCl在DNA周圍形成的離子氛將會削弱PBP與DNA之間的靜電作用力大小，那么溶液中有高濃度NaCl的n值就將比低濃度NaCl的n值低，如若不然則PBP與DNA之間就沒有靜電作用而很可能為溝槽作用。由表中可以看出，當NaCl濃度變大時n值均降低，這說明PBP與DNA之間存在靜電作用。

2.7 黏度法研究PBP與DNA之間的相互作用

一般而言，單獨的一種技術所給出的信息量是非常有限的，因此多種技術手段的聯用是很有必要的，這樣才能為研究小分子與DNA作用模式以及機理提供更加可靠的依據。而黏度測量這種流體力學的方法也是檢測小分子與DNA作用方式的一種非常簡便有效的方法［17－19］。當小分子PBP完全嵌入DNA堿基中發生嵌插作用時，DNA的鏈長將增加黏度值也將隨之增加;當小分子PBP只以靜電或者溝槽方式與DNA結合時，DNA分子結構不會發生形變則黏度值將幾乎不發生變化;當小分子PBP是以部分嵌入模式與DNA作用時，DNA分子結構就將發生扭結彎曲變形，此時DNA的黏度將會降低。配制一系列不同比例的DNA-PBP溶液，分別測定并記錄其相對黏度值，結果如圖9所示。由圖知，隨著DNA-PBP中PBP比例的逐漸增大，此時黏度值卻逐漸減小，這說明PBP只是部分的嵌入到DNA分子中，致使了DNA分子扭結變形而分子長度變短所致。這也就說明PBP與DNA之間的嵌插作用是部分嵌插。

圖9 PBP對DNA的黏度影響Fig.9 Influence on DNA viscosity with different concentrations of PBP

3 結論

在生理環境下，本文通過光譜以及黏度法研究了PBP與鯡魚精DNA之間的相互作用，研究發現PBP可以與鯡魚精DNA發生作用并以摩爾比為2∶1的比例形成了PBP－鯡魚精DNA復合物。在通過各種手段檢測發現PBP與鯡魚精DNA之間主要通過部分嵌插以及靜電作用方式發生作用。

在實驗中還通過熱力學研究法計算得出了在不同溫度下PBP與鯡魚精DNA的結合常數=2.16×105L/mol，=9.67×104L/mol，說明在低溫時PBP與鯡魚精DNA的結合力度更大，這也得到了熱力學函數中焓變值得證實，降低溫度將會有利于反應進行，通過結合常數也計算出了各種熱力學函數= －6.18 ×104J/mol，= －1.05×103J/(mol·K)，= －3.04×104J/mol。熱力學函數值說明了PBP與鯡魚精DNA是可以自發的進行反應形成PBP－鯡魚精DNA復合物的，而在這一過程中焓是主要的驅動力。

［1］HASLAM E.Plant polyphenols:vegetable tannis revisited［M］.Cambridge University Press，1989:178.

［2］方元超，楊柳，白小佳.茶葉活性成分的功能性質［J］.中國食品添加劑，1999(1):9－12.

［3］陳尚武，馬會勤，陳雷，等.葡萄酒中的白藜蘆醇及其衍生物［J］.食品與發酵工業，1999，25(4):53－55.

［4］潘志芬，潘開文.大豆及大豆制品中異黃酮的研究現狀［J］.四川農業大學學報，1999，17(2):56－57.

［5］PRATT D E.Water soluble antioxidanu activity in soybeans［J］.Food Science，1972，37(2):322 －323.

［6］LU Y R，FU L Y.Antioxidant activities of polyphenols from sage(Salvia o.cinalis)［J］.Food Chemistry，2001，75:197－202.

［7］IVANOVA D，GEROVA D，CHERVENKOV T，et al.Polyphenols and antioxidant capacity of Bulgarian medicinal plants［J］.Journal of Ethnopharmacology，2005，96:145－150.

［8］SKERGET M，KOTNIK P，HADOLIN M，et al.Phenols，proanthocyanidins，flavones and flavonols in some plant materials and their antioxidant activities［J］.Food Chemistry，2005，89:191－198.

［9］SOONG Y Y，PHILIP J B.Antioxidant activity and phenolic content of selected fruit seeds［J］.Food Chemistry，2004，88:411－417.

［10］HEO S J，PARK E J，LEE K W，et al.Antioxidant activities of enzymatic extracts from brown seaweeds［J］.Bioresour Technol，2005，96(14):1613 －1623.

［11］席小莉，楊曼曼，楊頻.6－芐氨基嘌呤及其金屬配合物與DNA的作用機理［J］.無機化學學報，2005，21(12):1847－1852.

［12］YANG H，WANG X M.Spectroscopic studies on the interaction of β-cyclodextrin-8-hydroxyquiuolineinclusioncomplex with herring sperm DNA［J］.Journal of Molecular Structure，2013，1036:51 －55.

［13］ZHOU Y L，LI Y Z.Studies of interaction between poly(allylamine hydrochloride)and double helix DNA by spectralmethods［J］.Biophys Chem，2004，107(3):273－281.

［14］徐春，何品剛，方禹之.溴化乙錠標記DNA電化學探針的研究［J］.高等學校化學學報，2000，21(8):1187－1190.

［15］WU K C，LIPPARD S J.Binding of platinum and palladium metallointercalation reagents and antitumor drugs to closed and open DNAs［J］.Biochemistry，1978，15(19):4339－4346.

［16］GUO M L，YANG P，YANG B S.Ethidium bromide as a fluorescent probe for the interaction mode between titanocene dichloride and DNA［J］.Chin Sci Bulletin，1996，41:1098–1103.

［17］CHEN Q Y，LI D H，ZHAO Y，et al.Interaction of a novel redregion fluorescent probe，nile blue，with DNA and its application to nucleic acids assay［J］.Analyst，1999，124(6):901－906.

［18］龍俊，段雷雨，王興明，等.β-環糊精-4-芐氧基苯酚包合物與DNA的相互作用［J］.中山大學學報:自然科學版，2013，52(6):86－92.

［19］LONG J，WANG X M，XU D L，et al.Spectroscopic studies on the interaction mechanisms of safranin T with herring sperm DNA using acridine orange as a fluorescence probe［J］.Journal of Molecular Recognition，2014，27:131－137.