HAIN用于檢測原發性耐藥結核的研究

劉亞芹，楊振斌，馮冬霞

（聊城市傳染病醫院 檢驗科，山東 聊城252000）

HAIN是由德國Hain Lifescience公司推出的一種檢測結核菌對異煙肼和利福平是否耐藥的技術，該技術基于多重PCR擴增，擴增產物通過反向雜交技術與預先固化在試紙條上的特異性探針雜交，通過雜交條帶的顯色情況來判定結核菌對利福平和異煙肼的耐藥性。HAIN技術6h出結果，比常規比例法藥敏（60天）快的多。原發耐藥結核病是指沒有接受過抗結核藥物治療而發生耐藥的菌株感染引起的疾病，對該病的耐藥檢測常規采用比例法，我國每年新發結核病人近百萬，如此嚴重的疫情，急需新的檢測方法，我們通過收集新發涂陽結核病人的痰標本，對標本分別進行培養、比例法藥敏和HAIN（線性探針）檢測，來分析HAIN在原發耐藥結核檢測中的可行性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標本來源 隨機抽取我市2012年7月至2013年3月新發痰涂片陽性的病人338例，選其痰標本2個。一個用HAIN檢測，一個進行培養和比例法藥敏。

1.1.2 標準菌株 H37RV即結核分枝桿菌（ATC C27294），由山東省胸科醫院漢光國際感染疾病研究中心贈與。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 ①HAIN方法：生物安全柜、博日Life Touch基因擴增儀、Twincubator雜交儀、水浴鍋、超聲破碎儀、離心機、雜交儀，水浴鍋，移液器（1000μl，200μl，10μl）3套。②培養和比例法藥敏設備：培養基蒸汽凝固滅菌器，ZHN－4型，中國原子能科學研究院；電子天平，FA1604型，上海舜宇恒平科學儀器公司，精度達1／10000級。

1.2.2 試劑 ①HAIN方法，試劑：消化前處理液（4%NaOH，2.94%檸檬酸鈉，NALC），無菌 PBS，無菌蒸餾水，PNM，熱啟動Taq酶試劑盒，分子生物級水，Genotype試劑盒，蒸餾水。②比例法，標準麥氏比濁管，抗結核藥物純品：異煙肼（INH）、利福平（RIF）、氧氟沙星（OFL）、卡那霉素（KM）純粉，對硝基苯甲酸（PNB）培養基、噻吩－2－羧酸（TCH）培養基、L－J羅氏培養基。

1.3 方法

1.3.1 比例法 按照結核病診斷細菌學檢驗規程[1]進行如下操作。a.培養基制備：①基礎培養基：中性羅氏培養基。②含藥培養基：INH、RIF溶解、稀釋于基礎培養基中分裝7ml／管，斜置于蒸汽凝固滅菌器內，85℃凝固50min。制成的培養基37℃無菌試驗24h，檢查無污染，4℃避光保存，1個月內使用。b.培養。c.藥物敏感性試驗：制備菌懸液，刮取菌齡2－3周的結核分枝桿菌菌落（刮取斜面各個部分培養物），研磨，以0.5%吐溫－80生理鹽水稀釋，配成1mg／ml菌懸液。用22SWG標準接種環取2滿環1mg／ml菌液，平移至2ml滅菌生理鹽水中，即成10－2mg／ml菌液，再以同法稀釋成10－4mg／ml菌液，用22SWG標準環分別取1滿環10－2mg／ml和10－4mg／ml菌液，用劃線法均勻接種至含藥培養基和對照培養基斜面上，37℃培養4周后報告結果。若耐藥百分比大于1%，則判耐藥。耐藥百分比＝含藥培養基的菌落數／對照培養基的菌落數×100%。

1.3.2 HAIN方法 a.DNA提取：取痰標本轉移到50ml離心管，中和離心法進行處理后，取1ml轉入1.5ml離心管。每管加150μl無菌水，95度水浴20min，超聲裂解15min，12 000rpm離心5 min。上清轉移到1.5ml離心管。b.PCR擴增：擴增體系配制50μl，取5μl DNA樣本到擴增體系中，15min 95℃1個循環，30sec95℃10個循環，2min 58℃、25sec 95℃、40sec、53℃、40sec 70℃30個循環，8min 70℃1個循環。c.雜交20μl變性液（DEN），20μl擴增產物混勻入槽，室溫5min，加1 ml 45℃預熱的 HYB（雜交緩沖液），放入DNA.strip，45℃30min，吸出 HYB，加 1ml漂洗液（STR），45℃15min，吸出STR，加入按1∶100稀釋的底物，室溫30min，吸出，洗滌3次，加底物顯色液室溫10min，加1ml水洗兩次。d.結果判讀說明：每個探針試條27個條帶，共4個區域：1區含3個條帶為標記物質控、擴增質控、結核分枝桿菌復合群（TUB）；2區為rpoB區含13個條帶分別是rpoB位點質控、rpoB野生條帶1到8（rpoBWT1、rpoBWT2……rpoBWT8）、rpoB突變條帶4條（rpoBMUT1、rpoBMUT2A、rpoBMUT2B、rpoBMUT3）；3區為katG區含4個條帶分別是katG位點質控、katG野生條帶（katGWT1）、katG突變條帶2條（katGMUT1、katGMUT2）；4區為inhA 區含8個條帶分別是inhA位點質控、inhA野生條帶2條（inhAWT1、inhAWT2）、inhA 突變條帶5條（inhAMUT1、inhAMUT1、inhAMUT2、inhAMUT3A、inhA3B）。耐藥：WT條帶缺失或MUT條帶出現；敏感：所有 WT條帶都出現且所有MUT條帶缺失；結核分枝桿菌復合群：TUB條帶出現；未檢測到結核分枝桿菌：TUB條帶缺失。

1.4 統計學處理

應用SPSS13.0軟件進行數據處理，對兩種方法在結核分枝桿菌耐藥檢測中的比較采用配對四格表資料的χ2檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 比例法結果

338例新發涂陽病人中，共培養出336株菌株，其中2株為污染，336例菌株經PNB、TCH初步鑒定，323株為結核分枝桿菌，13株為非結核分枝桿菌，對這13例病人HAIN方法的檢測結果均為：未檢出結核分枝桿菌（TUB條帶缺失）。這323例結核病人的菌株被納入比較分析，其比例法的藥敏結果是257株對INH、RIF兩種藥物全部敏感，18株只對INH耐藥，10株只對RIF耐藥，耐多藥（同時耐INH和RIF）的38株。

2.2 HAIN的結果、并與比例法比較

HAIN的結果是，56株比例法檢出為INH耐藥株（含38株同時耐INH和RFP的菌株）中，45株HAIN檢測為耐藥，其中katG（WT缺失，MUT1出現）35例，該情況在異煙肼耐藥中出現最多，占到了77.8%，其他包括katG（WT缺失，MUT2出現）4例，InhA （WT1缺失，MUT1出現）3例，InhA（WT2缺失，MUT3A出現）3例。48株比例法檢出為RIF耐藥株（含38株同時耐INH和RFP的菌株）中，46株檢出為RIF耐藥，其中rpoB（WT8缺失，MUT3出現）22例，該情況在利福平耐藥中出現最多，占到了47.8%，其他包括rpoB（WT7缺失，MUT2A出現）8例，rpoB（WT3或和 WT4缺失，MUT1出現）5例，rpoB（WT7缺失，MUT2B出現）3例，rpoB（WT7缺失，MUT全缺失）3例等。

HAIN與比例法對異煙肼耐藥性檢測的結果比較如下表1所示，χ2＝0.05，P＝0.823，兩種方法在檢測結核菌對異煙肼耐藥中差異無統計學意義，其靈敏性和特異性分別為80.4%和96.6%。

表1 HAIN與比例法對異煙肼耐藥性的檢測結果比較（以比例法為金標準）

對利福平耐藥性檢測結果的比較如下表2所示，χ2＝0，P＝1.000，兩種方法在檢測結核菌對利福平耐藥中差異也無統計學意義，其靈敏性和特異性分別為95.8%和99.6%。

表2 HAIN與比例法對利福平耐藥性的檢測結果比較（以比例法為金標準）

HAIN與比例法對耐多藥結核檢測結果的比較如下表3所示，χ2＝0.07，P＝0.790，兩種方法在對耐多藥結核的檢測中差異也無統計學意義，其靈敏性和特異性分別為78.9%和97.9%。

表3 HAIN對耐多藥結核的檢測結果與比例法比較（以比例法為金標準）

3 討論

HAIN技術，通過檢測RIF耐藥相關基因rpoB、INH的耐藥基因KatG、inhA基因啟動子的野生型及突變型，來判斷是否耐藥。在利福平耐藥菌株中95%以上是由于rpoB基因突變所致[2]HAIN法對RIF的檢測結果與比例法的藥敏復合較好，說明ropB、katG、inhA基因作為結核分枝桿菌耐藥性快速診斷標志具有很好的代表性，并且rpoB的位點突變中，531（對應 HAIN中rpoB的MUT3）、526（對應 HAIN 中rpoB的 MUT2A、MUT2B）位的突變最為常見[3]，除上述兩位點外，516（對應HAIN中rpoB的MUT1）等也是引起耐藥的原因。在對INH的檢測中，有20%的耐藥菌株 HAIN未檢出，原因有可能是，除KatG、inhA外，KaSA和ahpc基因也與異煙肼的耐藥有一定的關系，ahpc基因突變可導致ahpc表達增強，它的過量表達可以補償因KatG基因突變的損失，一般將ahpc基因作為KatG基因損傷的標志[4]，另外，除突變引起耐藥外，分枝桿菌存在藥物主動外排泵的表達，并被視為是可能的另一種重要耐藥機制[5，6]。

HAIN技術也有一定的局限性，操作過程中提取結核菌DNA時，因結核菌的細胞壁堅韌，裂解困難，提取效率不是太高，如果痰標本中結核菌數目少，或存在抑制DNA的物質，都可能造成假陰性[7]，另外HAIN中的PCR試驗很容易造成實驗室污染，可能導致假陽性。

38例耐多藥結核患者中，比例法顯示廣泛耐藥（XDR）的5例。本文應用HAIN技術中的 MTBDRplus，在檢測了結核菌對異煙肼、利福平的耐藥性后，又通過HAIN的另一項MTBDRs／檢測了38例耐多藥結核對氟奎諾酮、乙胺丁醇、氨基糖苷類／環肽類抗生素的耐藥性，結果與比例法的藥敏也有很高的一致性。

我國是27個結核病高負擔國家之一，不合理用藥、治療管理不善、藥物供應不足與質量不佳以及間斷用藥等導致耐多藥病例的發生，這些病例在未被發現或未得到有效治療時，作為傳染源，可使新被感染而發病的人，從一開始就是原發耐藥結核病患者。因此盡快發現和治療耐藥結核病人非常重要，只有減少了耐藥結核的病人，減少其在正常人群中傳播，才能有效減少原發耐藥結核病的發生，而HAIN的快速特點恰恰適合這一需求。我們通過HAIN技術對結核的原發耐藥性進行研究，了解了新發結核病人的耐藥特性，為臨床診斷、選擇和調整原發耐藥結核病的治療方案及時提供參考依據，在積極應對結核尤其是原發耐藥結核方面，HAIN與比例法相比差異無統計學意義，又因其快速，所以HAIN具有重要的應用價值。

[1]中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規程[J].中國防癆雜志，1996，18（3）：80.

[2]Pham M，Lemberg DA，Day AS.Probiotics：sorting the evidence from the Myths[J].Med J Aust，2008，188（5）：304.

[3]崔振玲，景奉香，胡忠義.基因芯片檢測結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性研究[J].中華結核與呼吸雜志，2004，7（27）：439.

[4]孫冰梅，車志宏.結核分枝桿菌耐藥的分子機制及耐藥基因檢測方法的研究進展[J].山西醫藥雜志，2005，4（4）：301.

[5]De Rossi E，Ainsa JA，and Riccardi G.Role of mycobacterial efflux transporters in drug resistance：an unresolved question[J].FEMS Microbiol Rev，2006：36.

[6]Colangeli R，Helb D，Sridharan S，et al.The Mycobacterium tuberculosis iniA gene is essential for activity of an efflux pump that confers drug tolerance to both isoniazid and ethambutol[J].Molecular Microbiology，2005：1829.

[7]張太松，李 明.分子診斷技術在耐多藥結核分枝桿菌檢測中的應用進展[J].分子診斷與治療雜志，2009，1（2）：129.