黃芪多糖對過氧化氫誘導大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧化損傷的保護作用

司俊康 郭俊國 唐 凱 杜宇翔 郭大東 王興榮

2山東中醫(yī)藥大學眼科研究所

3山東中醫(yī)藥大學附屬眼科醫(yī)院

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是嚴重影響人們生活質(zhì)量的主要致盲性眼病之一。DR的主要機制是高血糖造成的微血管病變，毛細血管功能障礙可以導致視網(wǎng)膜局部缺血缺氧以及由此引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cell，RGC）的氧化應(yīng)激損傷〔1-3〕。研究表明，通過藥物干預(yù)可以抑制DR患者RGC的凋亡，從而改善患者的視功能〔4〕。黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是從黃芪中提取的主要活性成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血糖等作用。有學者發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對于體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞具有抗氧化保護作用〔5〕，但是其對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞是否具有抗氧化保護作用尚不清楚。本實驗通過觀察黃芪多糖對過氧化氫誘導的大鼠RGC細胞氧化損傷的保護作用，為黃芪多糖及黃芪類藥物治療DR提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

傳代培養(yǎng)的RGC細胞株RGC-5由吉林大學白求恩第二醫(yī)院眼科醫(yī)院惠贈。RGC-5置于含10%胎牛血清（FBS）（美國 Hyclone公司)，1 g/L 葡萄糖和谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素的 Dulbecco改良 Eagle培養(yǎng)液（DMEM）（美國 Hyclone公司）的培養(yǎng)瓶中，于體積分數(shù)5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；隔夜換液，然后取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。 配制含 250 μg/ml、500 μg/ml、1 000 μg/ml黃芪多糖（西安奧澤生物科技有限公司）的DMEM高糖培養(yǎng)液；胰蛋白酶凍干粉（含EDTA）（美國Sigma公司）。流式細胞儀（美國BD公司），倒置相差顯微鏡（日本 OlympusⅨ71，日本 Olympus公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（美國伯騰儀器有限公司），實時細胞電子分析系統(tǒng)（xCELLigence System，瑞士Roche公司），Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（碧云天生物公司），噻唑藍（MTT）（美國 Sigma 公司），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國 Sigma公司）。

1.2 實驗分組

RGC-5細胞分為正常對照組、陰性對照組、過氧化氫損傷組、黃芪多糖干預(yù)組。正常對照組不做任何處理，陰性對照組和過氧化氫損傷組分別加入1 000 μg/ml的黃芪多糖和100 μmol/L的過氧化氫，黃芪多糖干預(yù)組在加入不同劑量濃度（1 000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml）黃芪多糖孵育 12 h 后加入 100 μmol/L的過氧化氫作用24 h，然后用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化。

1.3 MTT法檢測細胞活性

采用MTT比色法檢測RGC-5細胞的活性。取處于對數(shù)生長期的RGC-5，接種于96孔板，1×104個/L。按各個分組的要求處理后，每孔加入5 mg/ml的 MTT溶液 20 μL，孵育4 h，然后棄掉上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液 150 μl，低速振蕩 10 min，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度，細胞活性以相對于正常對照組的百分比表示。

1.4 DAPI染色

應(yīng)用DAPI染色觀察各組細胞核形態(tài)學變化。取處于對數(shù)生長期的RGC-5細胞，接種于6孔板，1×104個／L。按各組要求處理后，每孔用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，每孔加入4%的多聚甲醛固定液固定15 min，然后加入5 μg/ml的DAPI染色液室溫作用15 min。在倒置相差顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果。

1.5 實時細胞電子分析（RT-CES）

應(yīng)用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測各組細胞的生長的動態(tài)信息。RT-CES是基于檢測電子傳感器阻抗變化以反映細胞生理狀態(tài)的新型細胞分析系統(tǒng)。在RTCES系統(tǒng)中，傳感器培養(yǎng)板的底部有特殊的傳感器陣列，靶細胞可以直接生長在傳感器表面，造成傳感器阻抗的變化，從而實時記錄靶細胞的生長狀態(tài)。在RT-CES 系統(tǒng)中，應(yīng)用細胞指數(shù)（cell index，CI）來反映細胞的生長狀態(tài)〔6〕。將RGC-5細胞接種于16孔的RT-CES傳感器培養(yǎng)板上，密度1×104個/L，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，24 h后按上述實驗分組處理，記錄處理后72 h內(nèi)的細胞生長狀態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差表示，各樣本經(jīng)Levene檢驗總體方差相等，采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下各組細胞形態(tài)

正常生長的RGC-5細胞呈扁平梭形，細胞透亮，邊緣清晰，有較短突起，隨著細胞生長，突起相互連接（圖1A）。過氧化氫損傷組RGC-5細胞皺縮，細胞密度減低，軸突縮短（圖1C）。其他各組RGC-5細胞形態(tài)變化不大，僅見少量細胞皺縮（見圖1B，圖1D～圖 1F）。

圖1 各組RGC-5細胞倒置熒光顯微鏡像。1A.正常對照組；1B.陰性對照組；1C.過氧化氫損傷組；1D.1 000 μg/ml干預(yù)組；1E.500 μg/ml干預(yù)組；1F.250 μg/ml干預(yù)組。正常生長的RGC-5細胞呈扁平梭形，細胞透亮，邊緣清晰，有較短突起，隨著細胞生長，突起相互連接。過氧化氫損傷組RGC-5細胞皺縮，細胞密度減低，軸突縮短。其他各組RGC-5細胞形態(tài)未見明顯改變（×200倍）RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

2.2 MTT檢測

陰性對照組、過氧化氫損傷組以及1 000 μg/ml、5 00 μg/ml、250 μg/ml的黃芪多糖干預(yù)組的細胞活性分別為（98.17±1.06）%、（64.22±2.10）%、（88.14±2.62）%、（81.51±1.48）%、（78.37±1.64）%。 與正常對照組相比，過氧化氫損傷組RGC-5細胞的活性明顯降低（P＜0.01）。 與過氧化氫損傷組相比，1 000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml濃度的黃芪多糖干預(yù)組的細胞活性明顯升高（P＜0.01）（圖 2）。

圖2 各組RGC-5細胞活性檢測結(jié)果。A.正常對照組；B.陰性對照組；C.過氧化氫損傷組；D.1 000 μg/ml干預(yù)組；E.500 μg/ml干預(yù)組；F.250 μg/ml干預(yù)組 RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

2.3 DAPI染色

正常對照組（圖 3A）和陰性對照組（圖 3B）RGC-5細胞核核型完整，細胞核淡染，染色質(zhì)均勻，未見明顯凋亡表現(xiàn)；過氧化氫損傷組（圖3C）RGC-5細胞核發(fā)生形變，可見染色質(zhì)凝聚，邊緣化；各個濃度干預(yù)組（圖3D～圖 3F）的RGC-5細胞核基本完整，少量細胞可見染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象。

2.4 實時細胞電子分析（RT-CES）

圖4反映了不同分組細胞的生長狀態(tài)。從圖中可以看出，與正常對照組（曲線a）和陰性對照組（曲線b）相比，過氧化氫損傷組（曲線f）RGC-5細胞的生長明顯受到抑制。與過氧化氫組相比，不同濃度黃芪多糖干預(yù)組（曲線c、d、e）RGC-5細胞的細胞指數(shù)有所上升。

3 討論

近年來，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡與氧化應(yīng)激機制的研究越來越多。氧化應(yīng)激機制認為，細胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物積累導致細胞毒性損傷，從而造成細胞凋亡〔7-8〕。應(yīng)用過氧化氫損傷模擬體內(nèi)環(huán)境中細胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，已經(jīng)為眾多的實驗所證實〔9-14〕。本實驗在過氧化氫誘導RGC-5細胞氧化損傷的基礎(chǔ)上觀察黃芪多糖對RGC-5細胞的保護作用，從而探討黃芪多糖保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的作用機制，并為黃芪多糖的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

圖3 各組RGC-5細胞DAPI染色圖像。3A.正常對照組；3B.陰性對照組；3C.過氧化氫損傷組；3D.1 000 μg/ml干預(yù)組；3E.500 μg/ml干預(yù)組；3F.250 μg/ml干預(yù)組。正常對照組和陰性對照組RGC-5細胞核核型完整，細胞核淡染，染色質(zhì)均勻，未見明顯凋亡表現(xiàn)；過氧化氫損傷組RGC-5細胞核發(fā)生形變，可見染色質(zhì)凝聚，邊緣化；各個濃度干預(yù)組的RGC-5細胞核基本完整，少量細胞可見染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象（×200倍）RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

圖4 實時細胞電子分析。a.正常對照組；b.陰性對照組；c.1000μg/ml干預(yù)組；d.500 μg/ml干預(yù)組；e.250 μg/ml干預(yù)組；f.過氧化氫損傷組。與正常對照組相比，陰性對照組和各個濃度黃芪多糖干預(yù)組呈現(xiàn)正常的細胞生長曲線，過氧化氫損傷組細胞生長明顯受到抑制

黃芪是臨床上常用的補氣類藥物，在糖尿病及糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病中應(yīng)用較多。循證醫(yī)學證據(jù)也證實了黃芪類藥物對于糖尿病治療的有效性〔15〕。黃芪多糖是黃芪中提取的有效成分，具有增強心肌收縮力、擴張冠狀動脈、保護心肌細胞、改善心肌功能的作用，此外還有清除自由基、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫等多種有益的生物學效應(yīng)〔16-19〕。動物實驗證實，黃芪多糖對于周圍神經(jīng)損傷的功能恢復(fù)具有促進作用，而且在損傷早期即可發(fā)揮作用〔20〕。

在本實驗中，我們用過氧化氫誘導體外培養(yǎng)的RGC-5細胞氧化損傷，應(yīng)用不同濃度的黃芪多糖干預(yù)保護，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖干預(yù)組的細胞活性及細胞凋亡的數(shù)量較單純過氧化氫損傷組有明顯的逆轉(zhuǎn)，證實了黃芪多糖對過氧化氫誘導的RGC-5細胞氧化損傷的保護作用，提示黃芪多糖對于糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損傷可能有一定的保護作用，黃芪多糖可能是黃芪類藥物治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的有效成分之一。鑒于體外培養(yǎng)的RGC-5細胞與活體內(nèi)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞有一定差別，對各種損傷的反應(yīng)也可能會有所不同，所以黃芪多糖對于糖尿病視網(wǎng)膜病變RGC的保護作用及其在臨床上的治療效果和具體應(yīng)用還有待進一步研究。

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