癲疒間伴發抑郁大鼠模型建立及評價

楊 萍，李 亮*，孫美珍

（1.湖南省第二人民醫院精神科，湖南 長沙410007；2.湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南 長沙410208；3.山西醫科大學附一醫院神經內科，山西 太原030001）

癲疒間與抑郁共存被認為是一種常見的神經精神病學現象[1]。我們前期對鋰-匹羅卡品癲疒間大鼠進行抑郁篩選，挑選出伴發抑郁的大鼠，作為癲疒間伴發抑郁（epilepsy with depression，EWD）復合模型進行進一步研究，成功率僅約25%，實驗費用高而且資源頗為浪費[2]。 在此基礎上我們改良了造模方法，將傳統的“鋰-匹羅卡品癲疒間造模”與“慢性溫和應激刺激（chronic mild stress，CMS）抑郁造模”進行聯合，制備EWD 復合模型，并對此模型的建立和有效性做了系統的評價。 現將方法和結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和分組 成年雌性健康清潔級SD大鼠（動物使用合格證號43004700005442），體質量180～220 g， 由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供（動物質量合格證號SYXK(湘)2009-0001）。 標準飼料喂養，自由攝食飲水。 其間訓練飲用蔗糖水，測定蔗糖水消耗和曠場試驗基線值。 之后選擇行為學評分相近大鼠，隨機分為4 組：正常組8 只、癲疒間組11只、CMS 組9 只、癲疒間+CMS 組10 只。 癲疒間組采用鋰-匹羅卡品進行慢性癲疒間造模，CMS 組采用CMS進行抑郁造模，癲疒間+CMS 組在進行慢性癲疒間造模后再予以CMS 進行聯合造模以制備EWD 大鼠模型。 最終32 只大鼠納入統計，每組8 只。

1.1.2 實驗藥物 匹羅卡品（美國Sigma 公司，批號P1650000）；氯化鋰（美國Sigma 公司，批號62480）；5-HT1A 受體引物（武漢博士德公司合成）。

1.1.3 主要儀器 熒光定量PCR 儀（西安天隆科技有限公司，TL988）。

1.2 實驗方法

1.2.1 癲疒間模型制備 將癲疒間組大鼠腹腔注射氯化鋰3 mEq/kg，18 h 后再給予匹羅卡品30 mg/kg，在注射匹羅卡品前20 min 注射阿托品1 mg/kg 以拮抗外周膽堿能作用。 正常組注射30 mg/kg 生理鹽水。 根據Racine 分級標準[3]，造模后出現癲疒間持續狀態40 min即給予地西泮4 mg/kg 和10%水合氯醛3 mL/kg，終止急性期癲疒間發作，Racine≥IV 級并存活者入組。 存活大鼠隨后出現不同程度的慢性疒間性發作（如抽搐、點頭等），表明造模成功。 造模持續4 周。

1.2.2 CMS 模型制備 將CMS 組大鼠按Willner方法[4]加以改進制備抑郁模型，選擇以下9 種刺激每天隨機采取一種，共安排2 周。 （1）禁食、禁水20 h；（2）禁水17 h；（3）傾斜鼠籠（45 ℃）17 h；（4）濕籠（100 g 鋸屑墊料中加入200 mL 水）21 h；（5）持續光照17 h；（6）電擊（30 V 電壓）足底5 s；（7）4℃冰水游泳（水深15 cm，大鼠的后足尖剛能觸及桶底）5 min；（8）夾尾1 min；（9）行為限制2 h。

1.2.3 EWD 模型制備 針對癲疒間+CMS 組大鼠，將以上兩種造模方法進行聯合。 首先進行癲疒間模型制備，造模4 周后進行CMS 模型制備。

1.3 檢測方法

1.3.1 抑郁行為學檢測 造模后第6 周進行。 （1）糖水消耗試驗：造模前訓練大鼠適應飲糖水，每籠同時放置2個水瓶，第一個24 h，兩瓶均裝有1 %蔗糖水，隨后的24 h，一個瓶裝1%蔗糖水，另一個瓶裝純水。禁水24 h 后，進行動物的基礎糖水/純水消耗試驗。 同時給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水：1 瓶1%蔗糖水和1 瓶純水。 1 h 后，取兩瓶水稱量。 計算動物的糖水消耗、糖水偏愛（糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%）。 （2）曠場試驗：由不透明材料制成的76 cm×76 cm×42 cm 正方形敞箱，底面等分為25個等邊方格；晨7：30～12：00 在安靜的房間內觀察置于中心方格內的大鼠5 min 內垂直運動次數、水平運動次數。 徹底清潔敞箱后進行下一只大鼠的觀察。

1.3.2 5-HT1A 受體mRNA 表達的檢測 進行抑郁行為學檢測后麻醉后處死動物，取海馬齒狀回。 用Triziol 法提取總RNA，用反轉錄酶將mRNA 反轉錄為cDNA。 構建聚合酶體系（5-HT1A 受體的上游引物為5’-GCACCAGCTTAGGAACTTCG-3’， 下游引物為5’-CAGAGGAAGGTGCTCTTTGG-3’， 擴增片段長度206 bp；β-actin 的上游引物為5’-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’， 下游引物為5’-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3’， 擴增片段長度210 bp）；Taq 酶催化， 熱循環：95 ℃預熱5 min，40個循環(94 ℃20 s；退火20 s；72 ℃30 s)。 采用熒光實時定量PCR 法，將閾值循環數（Ct）值與不同濃度標準品的對數值擬合作圖， 得出校正曲線。 Ct值為mRNA 豐度定量標準，Ct 值越高， 代表mRNA豐度越低。 △△Ct=（實驗組目的基因Ct 值-實驗組內參基因Ct 值）-（正常組目的基因Ct 值-正常組內參基因Ct 值）。 通過2-△△Ct法根據目的基因與內參物（β-actin）Ct 值的比較，得到目的基因相對于內參基因的表達量，對5-HT1A 受體mRNA 表達水平進行定量，以此進行統計學分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 造模結果

癲疒間組癲疒間造模成功9 只，造模第10 天癲疒間大發作死亡1 只；CMS 組造模第37 天死亡1 只；癲疒間+CMS 組造模第13 天癲疒間大發作死亡1 只，造模第42 天死亡1 只。癲疒間+CMS 組大鼠均出現不同程度癲疒間發作，且伴有體質量、食欲下降、興趣喪失、活動減少。

2.2 大鼠抑郁行為學比較

與正常組比較，癲疒間組大鼠的抑郁行為學指標（糖水消耗、糖水偏愛、垂直及水平運動次數）沒有統計學意義，CMS 組各指標降低， 差異有統計學意義（P＜0.05），癲疒間+CMS 組則降低得更為明顯，差異有統計學意義（P＜0.01）；與癲疒間組比較，癲疒間+CMS組各指標降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與CMS組比較，癲疒間+CMS 組的糖水偏愛程度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。 結果見表1。

表1 各組大鼠抑郁行為學變化 （n=8，±s）

表1 各組大鼠抑郁行為學變化 （n=8，±s）

注：與正常組比較*P＜0.05，☆☆P＜0.01；與癲疒間組比較△P＜0.05；與CMS 組比較◇P＜0.05。

組 別正常組癲疒間組CMS 組癲疒間+CMS 組糖水消耗試驗糖水消耗（mL） 糖水偏愛（%）13.61±2.6 83.6±7.6 10.9±3.9 75.1±15.3 8.5±0.3* 64.9±9.4*7.6±2.8☆☆△ 55.1±13.7☆☆△◇曠場試驗垂直運動（次） 水平運動（次）21.6±2.1 58.2±13.1 17.4±4.4 49.2±17.5 5.3±1.6* 21.4±4.1*7.4±2.3☆☆△ 19.5±6.3☆☆△

2.3 大鼠5-HT1A 受體mRNA 表達比較

與正常組比較，癲疒間組、CMS 組、癲疒間+CMS 組大鼠的5-HT1A 受體mRNA 表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05），癲疒間+CMS 組降低的更為明顯；與癲疒間組比較，癲疒間+CMS 組5-HT1A 受體mRNA 表達無統計學意義；與CMS 組比較，癲疒間+CMS 組5-HT1A 受體mRNA 表達降低， 差異有統計學意義（P＜0.05）。 結果見表2、圖1。 圖1 為各造模大鼠5-HT1A 受體基因與內參基因溶解擴增曲線圖， 曲線呈下降趨勢，說明該指標檢測特異性高。

表2 各組大鼠海馬中5-HT1A 受體mRNA 表達比較（±s，n=8）

表2 各組大鼠海馬中5-HT1A 受體mRNA 表達比較（±s，n=8）

注：與正常組比較*P＜0.05；與CMS 組比較△P＜0.05。

組 別正常組癲疒間組CMS 組癲疒間+CMS 組5-HT1A Ct 值19.11±0.31 21.66±0.78 20.14±0.56 22.18±0.68內參Ct 值16.67±0.45 17.57±0.15 15.32±0.78 16.55±0.56△△Ct 值1.23±0.03 4.29±0.89 3.56±0.57 4.75±0.79 2－△△Ct 1.12±0.87 0.08±0.03*0.13±0.08*0.05±0.02*△

圖1 各造模大鼠5-HT1A 受體基因熒光變化曲線圖

3 討論

我國癲疒間的患病率在3.6‰～7.0‰[5]，EWD 的發生率為23.1%，明顯高于普通人群的抑郁發生率，且抑郁的終身患病率達到13%[6]。由此可見，癲疒間與抑郁共病現象非常普遍。

單純針對癲疒間或者抑郁的科學研究非常多，動物模型的制備亦比較成熟。 如氯化鋰-匹羅卡品誘導的癲疒間模型已被廣泛用于動物科研， 因為鋰-匹羅卡品誘導的癲疒間發作形式很接近人類慢性顳葉癲疒間特征，可反復出現癲疒間自發性發作， 與人類抑郁癥中慢性、低水平的應激源促進抑郁癥的發生及發展的機制更為接近[7]；抑郁模型的制備方法則有很多，包括CMS 模型、孤養或分養模型、獲得性無助和行為絕望、社會挫敗模型、大鼠嗅球切除等[8]。其中CMS 模型是目前最為公認的經典模型之一，廣泛應用于內源性抑郁障礙的病理生理機制和藥物作用機制研究。然而，目前國內外文獻對于WED 的研究則報導甚少。

在我們的前期研究中，首先利用鋰-匹羅卡品制備癲疒間大鼠模型， 隨后在此基礎之上通過行為學檢測進行抑郁篩選， 挑選出EWD 大鼠用于下一步研究，成功率低，費用高，效果不理想。 由此引發我們嘗試制備EWD 大鼠模型的思考。 理想的EWD 大鼠模型要求既能兼顧EWD 的神經生物學機制，又能體現抑郁的核心臨床癥狀，這是深入研究EWD 發生機制的前提和關鍵。該模型強調與人類EWD 存在以下相似點：（1）臨床核心癥狀相似，包括持續體現興趣減退和快感低下、 活動性明顯減少等抑郁最基本核心臨床癥狀學特征；（2）抗抑郁藥效應。 EWD 的癥狀更接近原發性抑郁[9]，如我們前期使用匹羅卡品癲疒間造模1月后有一部分大鼠出現運動能力下降， 興趣喪失，快感缺乏，侵犯攻擊能力下降的情況。 成熟的原發性抑郁模型制備方法能完全復制EWD 的抑郁癥狀，并為其模型建立提供相對確切的病因復制方法。EWD 模型亦應具備病理生理學效度，即體現疾病病理生理學特征，包括癲疒間臨床基本病理生理特征、癲疒間社會心理應激和／或生物學因素及其他相關危險因素，包括癲疒間后不良生活事件如抽搐，社會支持缺失等應激因素。 研究發現社會應激可加重癲疒間小鼠的被動躲避缺陷， 提示可將實驗性癲疒間和應激復合作為處理因素制備EWD 動物模型。

因此該研究將“鋰-匹羅卡品”與“CMS”進行聯合造模，最終發現癲疒間大鼠伴發抑郁的成功率可達到80%左右，遠遠高于前期研究中的25%。 在制模后6 周癲疒間組大鼠出現不同程度的癲疒間發作，但抑郁行為學與正常組相比無統計學意義，CMS 組出現興趣減退，活動性減退等情況，而癲疒間+CMS 組大鼠除出現癲疒間發作外，還出現抑郁行為學變化，即大鼠糖水攝入量明顯減少，表現出對食物獎賞刺激的低敏感性，類似于抑郁癥患者的快感缺失。 大鼠曠場水平運動評分減少， 反映動物的活動度降低；垂直運動減少， 反映動物對新鮮環境的好奇程度降低，說明癲疒間+CMS 組動物表現出抑郁狀態。

中樞單胺類神經遞質系統功能紊亂仍是抑郁癥生物學發病機制中最重要的假說， 研究顯示，EWD 的發生與神經遞質缺乏有關，特別是5-HT1A受體[10]。 5-HT1A 受體表達下降，則EWD 發病率上升。 本實驗結果顯示“鋰-匹羅卡品” 聯合“CMS”所制備出的EWD 大鼠模型組與正常組比較， 大鼠腦海馬區5-HT1A 受體mRNA 水平下降，結合以上行為學上的改變，說明該動物模型能有效的模擬EWD的發病狀態，提高造模成功率，大大降低實驗費用，是EWD 比較理想的大鼠模型。

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