COX多因素分析和ROC曲線綜合評價DNA修復基因對鼻咽癌的預后價值

楊 姣，蒿艷蓉，馮國生，陳甲信，鄧 珊，龐 強，秦 儉

(廣西壯族自治區 人民醫院 臨床腫瘤中心，廣西 南寧 530021)

研究論文

COX多因素分析和ROC曲線綜合評價DNA修復基因對鼻咽癌的預后價值

楊 姣，蒿艷蓉*，馮國生，陳甲信，鄧 珊，龐 強，秦 儉

(廣西壯族自治區 人民醫院 臨床腫瘤中心，廣西 南寧 530021)

目的應用COX多因素分析和ROC曲線探討DNA修復基因對鼻咽癌的預后價值。方法收集2007年5月至2012年2月經廣西壯族自治區人民醫院病理科確診為鼻咽癌且選擇調強放射治療的患者100例。篩選隨訪時間超過1年的患者共71例，用免疫組化SP法檢測鼻咽癌組織中DNA修復基因DNA-PKcs及BRCA1的表達。用Spearman分析DNA-PKcs和BRCA1的表達水平與臨床特征的相關性；ROC曲線法建立預后分組，用Kaplan-Meier生存曲線對DNA-PKcs、BRCA1的表達與預后關系進行單因素分析；Cox比例風險回歸對預后進行多因素生存分析。結果1)DNA-PKcs的表達水平和患者的生存時間呈正相關(Plt;0.05)。2)DNA-PKcs高表達患者的生存時間長于低表達的患者(Plt;0.01)。3)多因素生存分析，DNA-PKcs表達水平是影響預后的獨立因素(Plt;0.01)，而BRCA1表達水平未能得出類似結果。結論DNA-PKcs表達狀態是影響預后的獨立因素。DNA-PKcs高表達可能作為預測鼻咽癌患者預后較好的一個指標。

鼻咽癌；COX多因素分析；ROC曲線；DNA修復基因；預后

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是我國常見的惡性腫瘤之一，好發于中國南方各省，世界上80% 的鼻咽癌發生在中國，鼻咽癌發病率居頭頸部腫瘤的首位，發病年齡以30～50歲最為多見[1]。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，放射線通過其生物學效應作用于受照射細胞的遺傳物質，導致細胞無法修復而死亡。但其中一些沒有死亡但又無法完全修復的DNA末端可能參與染色體轉錄過程中的某些位點從而影響基因的穩定性[2]。本研究通過檢測DNA修復基因DNA-PKcs、BRCA1在鼻咽癌組織中的表達水平并結合臨床資料，利用COX多因素分析和ROC曲線綜合評價DNA修復基因對鼻咽癌的預后價值，以期為患者的個體化治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

DNA-PKcs和BRCA1兔抗人單克隆抗體濃縮型、SP免疫組化檢測試劑盒(兔)(北京博奧森公司)。

1.2 臨床資料

1.2.1 病例資料：本研究收集2007年5月至2012年2月經廣西壯族自治區人民醫院臨床腫瘤中心確診入院并采取調強放射治療的鼻咽癌患者100例。入組標準：1)經病理檢查證實為鼻咽癌且尚未進行任何腫瘤專科治療的初治患者，確診病例均有保存完好的鼻咽癌石蠟病理標本；2) 按照鼻咽癌 (AJCC sixth Edition 2002)分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa及Ⅳb期的患者；3)所有患者治療前均經鼻咽+顱底+頸部MRI平掃+增強的檢查證實具有可測量的腫瘤病灶且無遠處轉移；4)年齡17～76歲，PS評分≤2分；治療前血常規、肝、腎功能及心電圖各項指標均無異常；5)無合并癥及放化療禁忌者，無其他腫瘤病史；6)所有患者均簽署知情同意書。所有標本均由10% 中性甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋。采用免疫組織化學SP法染色。從患者出院后開始定期隨訪，隨訪日期截至2012年10月，中位隨訪31月，100例患者隨訪超過12月者71例。71例患者的臨床資料見表1。

表1 71例鼻咽癌患者臨床特征分布表

WHO.World Health Organization; AJCC.American Joint Committee on Cancer.

1.2.2 治療方法：Ⅰ和Ⅱ期患者接受單純根治性調強放射治療(intensity modulated radiation therapy，IMRT)。Ⅲ期、Ⅳa和Ⅳb期患者接受鉑類為主同步放化療。具體IMRT方案：所有患者均采用仰臥位、熱塑面罩固定頭頸肩部，以層厚2 mm行CT增強掃描定位，數據重建后傳入CMS或Pinnacle計劃系統。勾畫靶區包括：大體腫瘤體積(gross tumor volume，GTV)，臨床靶區(clinical target volume，CTV)、計劃靶區 (planning target volume，PTV)及危及器官，制定IMRT計劃，鼻咽大體腫瘤體積(GTV-nx)處方劑量68～72 Gy/30～32 f；頸部轉移淋巴結(GTV-nd)處方劑量68～72 Gy/30～32 f；臨床靶體積1(CTV1)58～62 Gy/30～32 f；臨床靶體積2(CTV2)50～6 Gy/30～32 f。 計劃驗證合適后進行治療。所有患者均接收根治性IMRT。化療方案：DDP 40 mg/m2，1次/周，放療期間同步應用6～7周，放療第1天同步開始。

1.2.3 療效評價方法：完成調強放射治療或者同步放化療后1個月，經鼻咽+顱底+頸部 MRI平掃+增強復查與治療前MRI對比，原發灶退縮的近期療效評價參照國際上通用實體瘤的療效評價標準(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)。

1.3 病理實驗

1.3.1 病理標本：選取上述病例中隨訪超過12個月且首診在廣西壯族自治區人民醫院患者的鼻咽癌組織病例標本共71例。

1.3.2 方法：采用免疫組織化學S-P法。免疫組化結果評定：DNA-PKcs和BRCA1陽性物質表達定位于細胞系。由有經驗的病理科主治醫師在不知道任何臨床和病理資料的情況下，通過光學顯微鏡，每張切片選5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，觀察腫瘤細胞免疫組化染色的情況并進行評分。根據陽性細胞百分比進行分組，陽性細胞計數 ≥50%定義為BRCA1高表達組；陽性細胞計數lt;50%及不表達者分別定義為BRCA1低表達組。統計分析時記(-)為低表達，(+)為高表達。

1.4 統計學分析

SPSS19.0軟件進行統計學處理。計數資料應用Spearman進行相關性分析，單向無序計數資料采用χ2檢驗。ROC曲線法建立預后分組，應用Kaplan-Meier生存曲線對DNA-PKcs、BRCA1的表達水平與預后關系進行單因素分析，log-rank檢驗分析生存曲線的差異；以Cox比例風險模型對預后進行多因素生存分析。

2 結果

2.1鼻咽癌組織中DNA修復基因免疫組化表達情況

71例鼻咽癌患者中DNA-PKcs高表達45例(59.2%)，低表達26例(40.8%)；BRCA1高表達31例(42.2%)，低表達40例(57.8%)(表2；圖1，2)。

表2 DNA-PKcs和BRCA1在鼻咽癌組織中表達情況

A.immunostaining for DNA-PKcs; B.BRCA1 in representative cases from the high DNA-PKcs groups and high BRCA1 groups; note the strong immunoreactivity predominantly in the nuclei of the tumor cells, magnification times

圖1DNA-PKcs和BRCA1免疫組化結果
Fig1ImmunohistochemicalresultsofDNA-PKcsandBRCA1(×400)

圖2 ROC曲線法建立患者預后分組示意圖Fig 2 Using ROC curve to establish the prognosisof patients

2.271例DNA-PKcs與BRCA1蛋白表達與臨床因素的相關性

2.2.1 DNA-PKcs、BRCA1表達情況與患者臨床特征相關性分析：DNA-PKcs與BRCA1表達情況與患者的年齡、性別、病理分型、T分期、AJCC分期及近期療效均無相關性(表3)。

2.2.2 根據ROC曲線法建立預后分組：根據ROC曲線把患者生存時間超過及等于32個月定義為預后較好組，生存時間小于32個月定義為預后較差組(Plt;0.05，圖2)，根據ROC曲線分組，DNA-PKcs的表達水平和患者的生存時間呈正相關(Plt;0.05)(表4)。

2.2.3 DNA-PKcs、BRCA1表達水平與預后單因素分析： 應用Kaplan-Meier生存曲線對DNA-PKcs、BRCA1表達水平與預后關系進行單因素分析，結果提示高表達患者的生存時間長于低表達的患者(Plt;0.01)(圖3)，不同BRCA1表達水平與患者生存時間關系無明顯相關性(圖4)。DNA-PKcs和BRCA1共同高表達組患者與非共同高表達組患者的生存曲線無明顯相關性，但共同高表達組患者顯示出生存時間更長的這種趨勢(P=0.057)(圖5)。

2.2.4 DNA-PKcs、BRCA1表達水平與預后多因素分析：應用Cox模型對預后進行多因素生存分析，結果顯示DNA-PKcs表達水平是影響預后的獨立因素，而BRCA1表達水平未能得出類似結果(表5)。

3 討論

本研究首次報道了DNA修復基因DNA-PKcs和BRCA1在蛋白水平的表達情況和鼻咽癌遠處轉移的關系。通過單因素分析觀察到：在鼻咽癌患者中，低表達DNA-PKcs者較高表達DNA-PKcs者更容易發生遠處轉移(圖3)。DNA依賴蛋白激酶(DNA-dependent Protein kinas，DNA-PK)，由3個亞基組成：Ku70、 Ku80以及DNA-PKcs，其中Ku70、 Ku80組成的二聚體是DNA-PK調節亞基， DNA-PKcs是DNA-PK催化亞基[3]。應用多因素分析最終得出DNA-PKcs高表達患者預后更好(表5)。但本課題假設的是：DNA-PKcs高表達患者應該具有更好的DNA修復能力，更容易產生放療抵抗，最終導致預后更差。本研究結果顯示,DNA-PKcs高表達者預后更好，這可能是因為DNA修復基因DNA-PKcs和BRCA1在維持基因穩定性方面也起著重要的作用[4]，DNA修復基因高表達提示修復損傷的DNA能力較強，低表達則提示修復損傷的DNA能力較弱，未能修復的DNA末端可能參與染色體的轉錄過程中的某些位點從而影響基因的穩定性[5]， 這種不可逆的損傷最終導致患者預后較差。同時DNA-PKcs的修復能力還與P53的表達水平密切相關，P53低表達但DNA-PKcs高表達者預后較好，P53高表達但DNA-PKcs低表達者預后較差[6]。不過產生這種現象的內在機制目前還不知道。再者，DNA-PKcs修復能力還受DNA-PK的活性調控，DNA-PK活性降低將會影響DNA修復能力，最終導致基因的不穩定以及染色體不可逆的損傷以及更高的遠處轉移發生率[7]。本研究得到和文獻[8]相似的結果，其在胃癌中的研究表明，DNA-PKcs低表達患者，腫瘤進展快且預后較差。乳腺癌基因BRCA1(breast cancer gene 1) 最早被確定是在1990年[9]。本實驗，沒有觀察到BRCA1的表達水平和臨床結果的相關性(表4)。目前BRCA1在乳腺癌中的研究較多，但BRCA1的表達水平與乳腺癌的預后的關系尚未十分明確，BRCA1的表達水平與乳腺癌預后有關[10]，BRCA1的表達水平與乳腺癌預后無關[11]。BRCA1蛋白參與許多不同而且復雜的細胞程序，而染色體對不同的誘變劑的敏感性不一樣。因此，BRCA1的不同突變在DNA損傷的識別和處理上都會有不同。BRCA1在鼻咽癌中尚無相關研究，BRCA1與鼻咽癌患者預后的關系還需要繼續研究。

表3 DNA-PKcs與BRCA1蛋白表達與臨床因素的相關性

CR.complete response; Non-CR.non-complete response.

表4 DNA-PKcs及BRCA1表達水平與患者生存時間分析

*P﹤0.05 compared with DNA-PKcs(-).

圖3 DNA-PKcs不同表達水平的鼻咽癌患者生存曲線Fig 3 Survival curves of different DNA-PKcs expressionlevels in patients with nasopharyngeal carcinoma

圖4 BRCA1不同表達水平的鼻咽癌患者生存曲線Fig 4 Survival curves of different BRCA1 expressionlevels in patients with nasopharyngeal carcinoma

The upper and lower arm represent patients with overexpression of DNA-PKcs(+) and BRCA1(+)and the non-overexpression of them, respectively; the lower curves includes DNA-PKcs(+) /BRCA1(-), DNA-PKcs(-) /BRCA1(+) and DNA-PKcs(-) /BRCA1(-)圖5 DNA-PKcs和BRCA1共同高表達組患者與非共同高表達組患者的生存曲線Fig 5 Survival curves in patients with nasopharyngealcarcinoma

表5 應用Cox模型對無轉移生存率進行多因素生存分析Table 5 Using the Cox model for multi-factor survival analysis metastasis-free survival

總之，DNA-PKcs高表達患者的生存時間明顯長于DNA-PKcs低表達患者，DNA-PKcs的表達水平可以作為預測鼻咽癌患者預后的一個生物指標。BRCA1暫未見BRCA1在鼻咽癌中的研究，BRCA1與鼻咽癌患者預后的關系還需要繼續研究。

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Combinating COX multivariate analysis with ROC curve to evaluatethe prognostic value of DNA repair gene in nasopharyneal carcinoma

YANG Jiao, HAO Yan-rong*, FENG Guo-sheng, CHEN Jia-xin, DENG Shan, PANG Qiang, QIN Jian

(Dept. of Chemotherapy, Clinical Cancer Center, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China)

ObjectiveUsing COX multivariate analysis and ROC curve to evaluate the prognostic value of DNA repair gene in patients with nasopharyngeal carcinoma.MethodsFrom May 2007 to February 2012, all 100 untreated patients with NPC, who were planned to receive IMRT at the People’s Hospital of Guangxi Autonomous Region were enrolled into this study. Screening for more than 1 year follow-up of 71 cases, formalin-fixed tumor biopsy specimens from 71 untreated patients with NPC were analyzed by immunohistochemical methods. Spearman’s analysis was put into use in the correlation ofDNA-PKcsandBRCA1 expression level and clinical characteristics. Kaplan-Meier survival curves analyzed the relationship between expression ofDNA-PKcsandBRCA1 and prognostic groups which were established by ROC curves. And Cox proportional hazards regression multi-factor survival analysis was carried out on the prognosis at last.Results1)There was a significant positive correlation between the expression level of DNA-PKcs and survival time of patients (Plt;0.05). 2)Moreover, patients with high DNA-PKcs

expression survived longer than patients with low level of DNA-PKcs(Plt;0.01). 3) On multivariate analysis, only DNA-PKcs expression level was an independent prognostic factor(Plt;0.01). No significant association was found between the level ofBRCA1 expression and the clinical outcome.ConclusionsDNA-PKcs expression level is an independent factor in prognostic and the patients with high level had a longer survival.

nasopharyngeal carcinoma; COX multivariate analysis; ROC curve; DNA repair genes; prognosis

2013- 12- 27

2014- 04- 29

國家自然科學基金(81260348)；廣西衛生廳重點項目(桂衛重2010037)

*通信作者(correspondingauthor)：yanronghao.2008@aliyun.com

1001-6325(2014)10-1333-06

R 739.62

A