自體及健康人CIK細胞治療臨床惡性腫瘤的比較

李 壯，董晨輝，徐 祥，何 靜，黃 宏，郭 韡，邢 偉，王愛民*

(第三軍醫大學 第三附屬醫院 野戰外科研究所 1.關節四肢外科； 2.干細胞移植amp;細胞治療中心；3.第一研究室 創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室， 重慶 400042)

自體及健康人CIK細胞治療臨床惡性腫瘤的比較

李 壯1，董晨輝1，徐 祥2，何 靜2，黃 宏3，郭 韡3，邢 偉3，王愛民1*

(第三軍醫大學 第三附屬醫院 野戰外科研究所 1.關節四肢外科； 2.干細胞移植amp;細胞治療中心；3.第一研究室 創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室， 重慶 400042)

目的比較惡性腫瘤患者和健康人來源的細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK cells)體外抗瘤效應和臨床療效。方法惡性腫瘤患者(n=12)和健康人(n=12)外周血單個核細胞(PBMC)經IFN-γ、CD3 Ab、IL-1和IL-2體外誘導獲得CIK，錐蟲藍染色檢測體外增殖，CCK-8檢測抑瘤活性，流式細胞術檢測細胞表型，PCR分析CIK在患者外周血的代謝，最后比較近期療效。結果健康人CIK較患者CIK體外增殖快、CD3+CD56+比例高且抑瘤效應強(Plt;0.01)，能在患者外周血中存在5～8 周并有效改善其免疫機能，兩者近期療效無顯著差異。結論健康人CIK治療惡性腫瘤高效可行，有著廣闊的臨床應用前景。

細胞因子誘導的殺傷細胞；惡性腫瘤；T淋巴細胞亞群

細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells, CIK cells)由單個核細胞經IFN-γ、CD3 Ab、IL-1和IL-2體外誘導得到，兼有NK細胞非MHC限制性殺瘤和T淋巴細胞的高抗瘤活性，臨床用于多種惡性腫瘤的治療[1-2]。目前，CIK主要由患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)誘導獲得，關于健康人CIK細胞的臨床應用鮮有報道。本研究通過與惡性腫瘤患者CIK比較，以初步探討健康人CIK的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集第三軍醫大學第三附屬醫院2012 年4 月至2013 年4 月行CIK治療的24 例惡性腫瘤患者，男性10 例，女性14 例，平均年齡(60.2±14.3)歲，其中肺癌8 例，肝癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌和宮頸癌各2例，牙齦癌、胃癌、食道癌、結腸癌、前列腺癌和骨肉瘤各1 例，KPS評分gt;60 分，預期生存gt;3 個月，臨床常規治療均結束4 周以上。根據CIK來源分為自體CIK及健康人CIK治療組，各12 例患者，后者包括8 名接受男性親屬CIK治療的女性患者。所有患者或其法定代理人簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養基(Gibco公司)，INF-γ(上海克隆高科公司)，CD3 Ab(Ebioscience公司)，IL-1(Schering Plough公司)，IL-2(北京四環生物公司)，熒光素標記的抗體及IgG同型對照(Beckman Coulter公司)，CCK-8(南京凱基生物公司)，DP1801試劑盒(北京百泰克生物公司)。人結腸癌細胞系HCT116和人肝癌細胞系HepG2由第三軍醫大學野戰外科研究所提供。

1.3 主要方法

1.3.1 CIK細胞的體外誘導培養：培養方法參照文獻[3]，當14 d CIK擴增達治療量且質檢合格后離心收集細胞，以100 mL含1% 人血白蛋白的0.9%氯化鈉注射液重懸后靜脈輸注。每療程分3 次輸注，細胞總數gt;1010個。

1.3.2 CIK細胞增殖活性及表型的分析：3、7和14 d時錐蟲藍染色計數活細胞，并取適量細胞經流式細胞術檢測表型。

1.3.3 CIK細胞體外抑瘤活性測定：以健康人PBMC、患者和健康人CIK為效應細胞，HCT116和HepG2為靶細胞，效靶比為5∶1、10∶1、20∶1和40∶1，作用24 h后加入CCK-8，測量450 nm波長處A值。計算抑瘤率%=[1-(實驗組A值-效應細胞A值)/靶細胞A值]×100 %。

1.3.4 患者接受CIK治療前后T淋巴細胞亞群變化：采集患者治療前及治療4、8和12 周后100 μL外周血，加熒光素標記的抗體及同型對照經流式細胞儀檢測，以12 例平均年齡(61.2±13.6)歲健康人作為對照。

1.3.5 常規PCR檢測男性CIK輸注后女性患者外周血中SRY基因變化：8 例女性患者接受男性親屬CIK細胞治療前后采集100 μL外周血，以DP1801試劑盒提取DNA，設置正常男女對照。Y染色體性別決定基因(sex determining region on Y，SRY)引物序列(254 bp)：上游：5′-CATGAACGCATTCATCGTG TGGTC-3′，下游：5′-CTGCGGGAAGCAAACTGCAA TTCTT-3′，GAPDH(532 bp)作為內參基因。反應體系含100 ng DNA，1 μL引物，反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環，72 ℃ 10 min，取10 μL產物行瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.6 臨床療效分析：參照文獻[4]進行，將患者治療60 d后KPS評分、疼痛強度和體質量變化作為主要指標，評估臨床收益反應(clinical benefit response，CBR)。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 CIK細胞的體外增殖和表型檢測

3 d起健康人CIK增殖和CD3+CD56+升高明顯快于患者細胞(Plt;0.01)(表1，2)。

表1 CIK細胞體外增殖倍數Table 1 Proliferation of CIK cells(±s, multiples, n=12)

*Plt;0.01 compared with autologous CIK.

表2 CIK培育過程中CD3+CD56+變化Table 2 Changes of CD3+CD56+ subset during culturing of CIK cells(±s, %, n=12)

*Plt;0.01 compared with autologous CIK.

2.2 CIK細胞體外抑瘤活性檢測

CIK對HCT116或HepG2的抑制活性與效靶比成正比，各個相應效靶比健康人CIK抑瘤活性均強于自體CIK，PBMC效應相對較弱(Plt;0.01)(圖1)。

2.3 患者治療前后外周血淋巴細胞亞群變化

與對照組相比，患者治療前CD3+、CD4+和NK降低，CD8+升高，CD4+/CD8+降低，CIK代償性升高。治療后以上指標均有改善，健康人CIK治療組CD3+、CD4+改善更明顯，至12周左右降至治療前水平(表3)。

2.4PCR檢測異體CIK細胞治療后SRY在外周血中的變化

治療前8 例患者血中均未檢出SRY基因，治療后254 bp處可見目的條帶。其中在輸注后5、7和8周各有1例、5例和2例可檢出SRY(圖2)。

*Plt;0.01 compared with autologous CIK； #Plt;0.01 compared with PBMC圖1 PBMC、自體及健康人CIK對HCT116(A)和HepG2(B)抑制效應的比較Fig 1 Comparison of cytotoxicity against HCT116(A) and HepG2(B) of PBMC, autologous or healthy

表3 患者接受自體或健康人CIK細胞治療前后外周血T淋巴細胞亞群變化Table 3 Analysis of T lymphocyte subset of patients treated with autologous or healthy CIK (±s, %, n=12)

*Plt;0.01 compared with autologous CIK；#Plt;0.01 compared with healthy control.

M.DL2000；C1.female control；C2.male control；P.before infusion；0 day～9 weeks.after infusion圖2 常規PCR檢測女性患者接受男性CIK治療前后外周血中SRY基因Fig 2 Detecting SRY in peripheral blood of female patients treated with male-derived CIK by PCR

2.5 臨床療效評價及不良反應

60 d時兩組患者KPS評分、疼痛和體質量改善及CBR均無顯著差異(表4)。3 例自體CIK治療和5例健康人CIK治療的患者在回輸時出現低熱、寒戰，24 h內自行恢復正常，1例健康人CIK治療的患者在2周后出現雙側脛前皮膚瘙癢，對癥處理后緩解。所有患者無心悸、胸悶、嘔吐和腹瀉等不適。

表4 自體及健康人CIK細胞治療組療效比較Table 4 Comparison of therapeutic effect betweenautologous and healthy CIK(%,n=12)

3 討論

手術和化放療仍是目前臨床治療惡性腫瘤的主要方法，但手術無法徹底清除腫瘤細胞，而放化療殺傷腫瘤細胞的同時也損傷正常細胞，進一步破壞機體免疫甚至降低生存質量。作為配合臨床常規治療的重要手段，CIK細胞具有體外擴增速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣和毒副作用小的特點，被認為是腫瘤過繼免疫治療的新希望[5]。但晚期惡性腫瘤患者免疫功能常有不同程度抑制，外周血白細胞數量和活性降低，抽血分離PBMC可能會加重貧血和誘發感染。此外，由于細胞狀態受損及“腫瘤免疫編輯”[6]，自體CIK治療惡性實體腫瘤的有效性僅30%左右[7]，因此健康人CIK細胞是否可以作為一種安全有效的治療手段應用于臨床也就成為關注的焦點[8]。

動物實驗證實異體CIK細胞在受者體內可持續存在約90 d，同時保持其抗腫瘤效應而不引起明顯的不良反應[9]，在本研究中，相較于惡性腫瘤患者CIK，健康人CIK細胞體外增殖速度快、CD3+CD56+比例高且抑瘤效應強，輸注后能有效改善患者的免疫功能，在得到與自體CIK類似療效的同時并未明顯地增加不良反應。盡管由于樣本量少和觀察周期短等原因，本研究中未發現健康人CIK具有更好的療效，此外有關自體CIK細胞在患者體內的代謝還有待進一步研究，但應用健康人CIK細胞能夠避免抽血等對患者的損傷，縮短患者等待治療的時間以爭取治療時機，從而為晚期惡性腫瘤特別是伴明顯免疫機能受損的患者提供了一個實施CIK治療的新方法，有著廣闊的臨床應用前景。

[1] Linn YC, Niam M, Chu S. The anti-tumour activity of allogeneic cytokine-induced killer cells in patients who relapse after allogeneic transplant for haematological malignancies [J]. Bone marrow transplant, 2012, 47: 957-966.

[2] Zhang J, Zhu L, Wei J,etal. The effects of cytokine-induced killer cells for the treatment of patients with solid tumors: a clinical retrospective study [J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012, 138: 1057-1062.

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[8] Linn YC, Niam M, Chu S. The anti-tumour activity of allogeneic cytokine-induced killer cells in patients who relapse after allogeneic transplant for haematological malignancies [J]. Bone Marrow Transplant, 2012, 47: 957-966.

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Comparison of clinic application in malignant tumor immunotherapy between autologous and healthy CIK cells

LI Zhuang1, DONG Chen-hui1, XU Xiang2, HE Jing2, HUANG Hong3, GUO Wei3,XING Wei3, WANG Ai-min1*

(1.Dept. of Joint and Orthopedic Surgery; 2.Stem Cell Transplantation amp; Cell Treatment Center; 3.State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Dept. of Institute of Surgery Research, the Third Affilited Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400042,China)

ObjectiveTo compare the clinical anti-tumor effect of cytokine-induced killer cells(CIK) derived from patients with malignancies or healthy doners.MethodsPeripheral blood mononuclear cells(PBMC) of patients(n=12) or healthy doners(n=12) were cultured in presence of IFN-γ, CD3 Ab, IL-1 and IL-2. The proliferation was counted by Trypan blue test, theinvitroanti-tumor cytotoxicity was analysed by CCK-8 assay, the phenotypes were analyzed by flow cytometry, the duration of healthy CIK was determined by PCR, the clinical effects were compared.ResultsCompared with autologous CIK, healthy CIK showed higher proliferative ability and enhancedinvitroanti-tumor cytotoxicity(Plt;0.05), and led to an efficient recovery of immunologic function of recipients. 5～8 weeks after infusion, healthy CIK was also detected in recipients’ peripheral blood. More importantly, healthy CIK showed equivalent therapeutic effect and minimal adverse reactions.ConclusionsApplication of healthy CIK cells in the treatment of malignancies is probably feasible.

cytokine-induced killer cells; malignancy; T lymphocyte subset

2013-08-09

2013-10-30

國家自然科學基金(81372027)

*通信作者(correspondingauthor)： trauma2@163.com

1001-6325(2014)04-0475-05

研究論文

R 73-36； R 730.51； R 394.2

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