北京地區兒童急性上呼吸道感染中腸道病毒感染譜的分析

李霖琳，謝正德，劉春艷，相子春，任麗麗，申昆玲，王健偉*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 病原生物學研究所, 北京 100730；2.首都醫科大學附屬北京兒童醫院 北京市兒科研究所 兒科學國家重點學科省部共建兒科重大疾病研究重點實驗室， 北京 100045)

北京地區兒童急性上呼吸道感染中腸道病毒感染譜的分析

李霖琳1，謝正德2，劉春艷2，相子春1，任麗麗1，申昆玲2，王健偉1*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 病原生物學研究所, 北京 100730；2.首都醫科大學附屬北京兒童醫院 北京市兒科研究所 兒科學國家重點學科省部共建兒科重大疾病研究重點實驗室， 北京 100045)

目的了解北京地區兒童急性上呼吸道感染中腸道病毒(EV)的感染譜。方法收集2009-05-09于北京兒童醫院就診的急性上呼吸道感染患者的咽拭子1 121份，用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法對EV的VP1基因進行了擴增并測序。結果發現55例為EV陽性，分屬14個血清型。其中44例屬于A種EV(EV-A)，11例為EV-B。檢出EV與手足口病及無菌性腦膜炎中檢測到的EV具有高度同源性，但和EV原型株相比較均產生了不同程度的變異。結論2009年北京地區急性上吸道感染兒童中以EV-A感染為主，與成人病原譜存在差異。

腸道病毒；呼吸道感染；感染譜

腸道病毒(enteroviruses, EV)是單股正鏈無包膜的小RNA病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。人EV分為A、B、C和D 4個種。EV-A包括24個血清型，EV-B包括61個血清型，EV-C包括23個血清型，EV-D包括5個血清型 (www.picornaviridae.com/enterovirus/)。EV可以引起呼吸道感染、無菌性腦膜炎、心肌炎和手足口病等多種疾病。

近年來，EV在呼吸道感染中的作用受到了廣泛重視，認為是中國兒童呼吸道感染的重要病原體、夏季呼吸道感染的主要病原體[1-4]。而由于EV的血清型眾多，哪些血清型與呼吸道感染相關尚未闡明，國內以往的報道卻未對呼吸道感染中檢測到的EV進行分型研究。本研究對北京地區兒童上呼吸道感染的臨床EV感染樣本進行了檢測和分型，以進一步了解EV血清型與呼吸道感染間的關系。

1 材料與方法

1.1 病例來源

2009-05-09首都醫科大學附屬北京兒童醫院門診臨床診斷為急性呼吸道感染的患兒共1 121例，其中男632例，女489例(男∶女=1.3∶1)。年齡分布為1個月～17歲，年齡中位數為38個月。

1.2 方法

1.2.1 標本采集:采集患者咽拭子，置4 ℃保存，72 h內運至實驗室分裝，凍存于-70 ℃。

1.2.2 核酸提取:自動核酸提取儀NucliSens easyMAGTM(法國生物梅里埃)進行DNA和RNA提取，保存于-70 ℃。

1.2.3 病毒核酸檢測:多重反轉錄聚合酶鏈反應(multiplex RT-PCR)進行常見呼吸道病毒核酸檢測，包括流感病毒甲、乙、丙型(influenza viruses, IFV A、B、C)、副流感病毒1～4型(parainfluenza virus, PIV 1～4)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、鼻病毒(rhinovirus, HRV)、偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)、腺病毒(adenovirus, AdV)、人冠狀病毒(human coronavirus, HCoV)、博卡病毒(human bocavirus, HBoV)和EV。詳細檢測方法和引物序列見文獻[5]。

1.2.4 EV的分型檢測:RT-PCR方法擴增EV的VP1區，詳細檢測方法和引物見文獻[6]。對擴增的產物進行T-A克隆后測序。和EV各血清型的原型株進行序列比對，VP1 區核苷酸同源性≥75%或氨基酸同源性≥88%，即認為是同一血清型[7]。

1.2.5 生物信息學分析:BioEdit 7.0.0版本進行多序列比對。Mega4.0軟件構建進化樹, 采用Kimura 2-parameter模型以鄰接法(neighbor-joining), 建樹的可靠性由1000 Bootstrap值評估。

2 結果

2.1 EV檢出情況

共檢測到55例EV陽性的急性上呼吸道感染患兒。其中男32例，女23例(男∶女=1.4∶1)。年齡分布為9個月～10歲，年齡中位數是38個月。除5月份外，EV在篩查的各個月份(6月到9月)均有檢出，其中以8月檢出率最高，達到10.1%。不同月份檢出率見(表1)。

表1 EV在不同月份的檢出率Table 1 Detection rate of EV

55例EV陽性的患兒中，12例存在與其他呼吸道病毒共感染的情況。其中1例與hMPV共感染、1例與IFVB共感染、1例與PIV4共感染、1例與HRV共感染、2例與RSV共感染、2例與ADV共感染、3例與PIV3共感染，1例與PIV1和HRV共感染。

2.2 EV的分型

在55例EV陽性的病例中，只檢測到A和B兩個種。EV-A陽性44例，包括7個血清型；EV-B陽性11例，包括7個血清型(圖1)。EV-A陽性病例中柯薩奇病毒(CV)A2和CVA6最多，各有10例；CVA12和CVA5分別為9例和8例；CVA10有4例，CVA8有2例，CVA16有1例。EV-B陽性的病例中CVB2最多，有4例；其次為CVA9，2例；CVB1、 CVB5、?？刹《?E)6、E19和E25各1例。在檢出率最高的8月份， 17例EV陽性分屬10個血清型。 EV-A、EV-B各有5個血清型。EV-A陽性病例中CVA2和CVA12最多，各3例；CVA16和CVA5各2例；CVA16有1例。EV-B陽性的病例中CVA9最多，2例；CVB2、 CVB5、E6和E25各1例。

圖1 EV的分型檢測結果Fig 1 Genotyping of enteroviruses in respiratory samples

2.3 EV臨床株的進化分析

和原型株比較，除CVB2的某些臨床株外，其余臨床株都發生了不同程度的變異(表2)。其中CVA2的某些臨床株變異度最大，核苷酸和氨基酸的同源性只有77.5%和87.8%。同一血清型臨床株間也有不同程度的變異，臨床株間變異最大的CVA2，在進化樹上分為3個分支(圖2)。另外，檢出的EV與在手足口病和無菌性腦膜炎患者樣本中EV的同一血清型序列比對發現，它們間具有高度的同源性(核苷酸序列≥96%)，在進化樹上處在同一分支上(圖2)。

2.4 氨基酸位點的突變分析

和原型株氨基酸比對發現，在VP1的第81位和82位氨基酸存在3種突變模式，導致進化樹上呈現3個分支。第81位氨基酸由亮氨酸(L)突變為異亮氨酸(I)后在進化樹上獨立成為1支；而第81和82位聯合突變為異亮氨酸-甘氨酸(IG)或異亮氨酸-絲氨酸(IS)后在進化樹上另成1支；這兩個氨基酸突變為纈氨酸-絲氨酸(VS)后在進化樹上成為第3支(圖3)。

▲prototype；●clinical strains detected in this research；■clinical strains detected in hand-foot-mouth disease or aseptic meningitis圖2 EV基因組部分VP1基因的進化分析Fig 2 Phylogenetic analysis of the partial VP1 genes of enteroviruses in respiratory samples

3 討論

EV相關的呼吸道感染夏季高發，所以本研究對2009年5月至9月的兒童上呼吸道感染樣本進行了檢測，共檢測到14個血清型，說明上呼吸道感染中的EV存在多樣性。其中EV-A的病例占了EV感染病例的80%(44/55)，與成人EV感染情況不同[8]。成人感染以EV-C中的CVA21和EV-D中的EV68為主要病原， EV-B多于EV-A。但由于樣本時間跨度較短，不排除季節因素。

表2 EV各基因型分布及同源性比較Table 2 Serotype distribution and nucleotide homology between prototypes and clinical strains

圖3 CVA2的臨床株及原型株的氨基酸變化Fig 3 Comparison of amino acids between prototype and clinical strains of CVA2

此次檢測到的14個血清型也存在于手足口病和無菌性腦膜炎中[9-11]。進化分析發現同一血清型中不同疾病患者分離的病毒株間具有高度的同源性，在進化樹上位于同一進化支上，提示相同的病毒感染可引起多種臨床疾病如呼吸道感染、手足口病或無菌性腦膜炎等。

此外，臨床株VP1基因序列與原型株比較都有不同程度的變異，CVA2最為明顯，在進化樹上分為3個分支，其VP1蛋白第81和82位氨基酸的突變成為分支形成的關鍵。這兩個氨基酸在病毒進化中的作用，需要更多數據分析。通過所獲得的數據可以看出，CVA2在檢測到的EV中所占比例最高，在2012年深圳的手足口患者病原檢測中也位居第4位，因此CVA2在兒童中的致病作用應更加值得重視。

[1] 朱汝南，鄧潔，王芳，等.2000年秋冬至2002年夏北京地區急性呼吸道感染病毒病原學研究[J]. 臨床兒科學雜志，2003，21：25-28.

[2] 伏瑾，袁藝，孫麗萍，等.北京地區兒童急性呼吸道感染與腸道病毒關系探討[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志，2007，21：316-318.

[3] 張志勇，陳昕，楊錫強，等.重慶地區急性呼吸道感染兒童腸道病毒檢測結果分析[J].臨床兒科雜志，2008，26：473-476.

[4] 顧艷紅，劉蘭吉，孫利，等. 兒童急性上呼吸道感染夏季和冬季病毒病原學分析[J]. 中國全科醫學，2012，15：4079-4082.

[5] Ren L, Gonzalez R, Wang Z,etal. Prevalence of human respiratory viruses in adults with acute respiratory tract infections in Beijing, 2005-2007[J]. Clin Microbiol Infect，2009，15：1146-1153.

[6] Nix WA, Oberste MS, Pallansch MA. Sensitive, semi nested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens[J]. J Clin Microbiol，2006，44：2698-2704.

[7] Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR,etal. MA. Molecular evolution of the human enteroviruses: correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classification[J]. J Virol.，1999，73：1941-1948.

[8] Xiang Z, Gonzalez R, Wang Z,etal. Coxsackievirus A21, enterovirus 68, and acute respiratory tract infection, China[J]. Emerg Infect Dis，2012，18：821-824.

[9] He YQ, Chen L, Xu WB,etal. Emergence, circulation, and spatiotemporal phylogenetic analysis of coxsackievirus a6 and coxsackievirusa10-associated hand, foot, and mouth disease infections from 2008 to 2012 in Shenzhen, China[J]. J Clin Microbiol，2013，51：3560-3566.

[10] Hu YF, Yang F, Du J,etal. Complete genome analysis of coxsackievirus A2, A4, A5, and A10 strains isolated from hand, foot, and mouth disease patients in China revealing frequent recombination of human enterovirus A[J]. J Clin Microbiol，2011，49：2426-2434.

[11] 陳鵬，陶澤新，王海巖,等. 柯薩奇B5病毒所致無菌性腦膜炎暴發的病原學鑒定及基因特征分析[J]. 中華傳染病雜志，2012，30:146-151.

Spectrum analysis of enteroviruses in children with acute respiratory tract infections in Beijing

LI Lin-lin1，XIE Zheng-de2, LIU Chun-yan2, XIANG Zi-chun1, REN Li-li1,SHEN Kun-ling2, WANG Jian-wei1*

(1.Institute of Pathogen Biology, CAMS amp; PUMC, Beijing 100730; 2.National Key Laboratory of Major Diseases in Children and National Key Discipline of Pediatrics，Ministry of Education，Beijing Pediatric Research Institute，BCH-CMU，Beijing 100045, China)

ObjectiveTo determine the spectrum of enteroviruses (EV) in children with acute respiratory tract infections (ARTI) in Beijing.MethodsThroat swabs were collected from 1,121 children at the time of admission to the Beijing Children’s Hospital for ARTI during May 2009 through September 2009. To detect EV, the viral protein 1 (VP1) gene were amplified by reverse transcription PCR and verified the findings by sequence analysis.ResultsEV was detected in 55 children and 14 EV serotypes were identified. Among of them, 7 EV serotypes including 44 cases belonged to EV-A and the others belonged to EV-B. The sequences of EV in this research had very high homology with that detected in hand-foot-and-mouth disease or aseptic meningitis. Compared to prototype, mutations were happened in clinical strains.ConclusionsEV-A was dominant in children with acute respiratory tract infections which was different to that of the adult in Beijing in 2009.

enteroviruses; respiratory tract infections; spectrum of infection

2013-12-12

2014-01-07

國家科技重大專項“傳染病監測技術平臺”項目(2012ZX10004-206)

*通信作者(correspondingauthor)： wangjw28@163.com

1001-6325(2014)04-0485-05

研究論文

R 373.2

A