白藜蘆醇對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖及MsrA、CXCR4和MMP-13表達(dá)的影響

崔運(yùn)福，郝 濤，趙 碩，王榮華

(濱州醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院， 山東 濱州 256603)

白藜蘆醇對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖及MsrA、CXCR4和MMP-13表達(dá)的影響

崔運(yùn)福，郝 濤，趙 碩，王榮華

(濱州醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院， 山東 濱州 256603)

在許多植物(例虎杖，葡萄等)中都發(fā)現(xiàn)有白藜蘆醇(Resveratrol,Res)，最近對它抗癌作用的研究比較多[1]。Res可以抑制癌細(xì)胞增殖，并抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲，這在以往的體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得到證實(shí)[2]，但有關(guān)Res抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的報(bào)道較少，其抗腫瘤的確切機(jī)制亦不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過研究Res對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖及MsrA、CXCR4和MMP-13表達(dá)的影響，為Res今后在臨床中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料：低分化結(jié)腸癌SW480細(xì)胞(由美國Rockville研究所提供)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco公司)，青、鏈霉素(各100 U/mL)的DMEM培養(yǎng)基中，置37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。Res (Sigma公司)，用DMSO溶解后保存于-20 ℃。

1.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性：將處于對數(shù)增殖期的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞懸液調(diào)整為1×105個(gè)/L，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，去除培養(yǎng)基，再加入不同濃度(0、5、10、20和50 μmol/L)Res的培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)平行孔，同時(shí)將DMSO對照組置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,每孔加入MTT溶液20 μL, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL,室溫避光振蕩15 min，使結(jié)晶充分溶解，于酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處檢測吸光度值(A值)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)孔A值/6*對照孔A值)。

1.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將結(jié)腸癌SW480細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞匯合后進(jìn)行劃痕，PBS洗1遍，更換為無血清培養(yǎng)基，加入低濃度Res(10和50 μmol/L)24 h后觀察劃痕距離并拍照。

1.4 Western blot檢測蛋白變化情況：棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞3次，細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，離心，加入細(xì)胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),150 mmol/L NaCl,0.1% SDS,100 μg/mL PMSF,0.5% NP-40,0.5%脫氧膽酸鈉)4 ℃冰浴中超聲破碎細(xì)胞，4 ℃放置待細(xì)胞膜破碎，反復(fù)渦旋后于4 ℃ 12 000r/min離心，取上清，蛋白定量后，樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，將PVDF膜在10%牛奶中封閉1 h，加入1∶1 000的一抗，4 ℃溫育過夜，洗滌，加入酶標(biāo)二抗室溫1 h，PVDF膜經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光底物檢測特異蛋白。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測Res對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的細(xì)胞毒性：MTT法確定其給藥濃度，分別給結(jié)腸癌SW480細(xì)胞加入不同濃度Res(0、5、10、20和50 μmol/L)作用24 h，計(jì)算出抑制率為0%、5.4%、8.6%、15.3%和23.7%。

2.2 Res抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移及侵襲：Res組細(xì)胞劃痕距離明顯低于對照組細(xì)胞(圖1), Res可以抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的侵襲能力。

圖1 SW480細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 1 SW480 cells migration and invasion

2.3 Western blot 檢測蛋白水平：不同濃度Res處理結(jié)腸癌SW480細(xì)胞24 h后，MsrA表達(dá)明顯上調(diào)，而CXCR4、MMP-13表達(dá)量下降(圖2)。

2.4 siRNA MsrA后CXCR4與MMP-13的表達(dá)情況：永久沉默結(jié)腸癌SW480細(xì)胞MsrA基因，加入Res，與對照組相比， CXCR4與MMP-13蛋白有所上調(diào)(圖3)。

*Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with 0 μmol/L Res圖2 不同濃度Res作用SW480細(xì)胞24h后，MsrA與CXCR4、MMP-13蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果及含量變化分析Fig 2 Expression of MsrA, CXCR4 and MMP-13 protein in SW480 cells after treatment with resveratrol of different concentration for 24 hours and analized for changes of these protein

*Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with control圖3 不同濃度Res作用對照組和siRNA MsrA組24 h后，CXCR4、MMP-13蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果及含量變化分析Fig 3 Expression of CXCR4 and MMP-13 protein in control group and siRNA MsrA group after treatment with resveratrol of different concen- tration for 24 hours and analized for changes of these protein

3 討論

研究表明，Res具有抗腫瘤特性，可以抑制人乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和急性早幼粒白血病細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，低濃度的Res能抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖，在未出現(xiàn)凋亡時(shí)，Res也可以抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷徙，用藥濃度越高遷徙率越低。

甲硫氨酸亞砜還原酶(methionine sulfoxide reductase A,MsrA)，是Msr家族之一，是一種修復(fù)系統(tǒng)的重要蛋白，以往研究表明MsrA表達(dá)增加可以明顯抑制癌細(xì)胞的侵襲能力，同時(shí)可以輕度降低其增殖能力，表明MsrA有抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與增殖的作用。基因趨化因子受體CXCR4是趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(CXCL12)的特異受體，其與腫瘤的增殖、分化和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。MMP-13 (又稱為膠原酶-3)最先在乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)，以后的研究相繼發(fā)現(xiàn)在其他腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)了 MMP-13 的表達(dá)，而癌前和良性病變中MMP-13不表達(dá)[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Res可以使結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)MsrA上調(diào)，而CXCR4與MMP-13下調(diào)，這與Res的作用有密切關(guān)系，低濃度Res在不導(dǎo)致結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的同時(shí)會抑制其侵襲與遷徙，高濃度Res可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。Res可以激活MsrA蛋白，同時(shí)抑制CXCR4與MMP-13蛋白，但沉默MsrA基因，加入Res后，CXCR4與MMP-13蛋白被抑制的作用有所緩解，說明在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中MsrA在一定程度上起到抑制CXCR4與MMP-13蛋白的作用，更具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

[1] 陸艷紅,李永軍.白藜蘆醇在腫瘤基因調(diào)控中作用的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,26:20-21.

[2] Shao J,Li X,Lu X,etal. Enhanced growth inhibition effect of Resveratrol incorporated into biodegradable nanoparticles against glioma cells is mediated by the induction of intracellular reactive oxygenspecies level[J].Colloids Surf,2009,72:40-47.

[3] Chris De Savi, Andrew D. Morley,Selective non zinc binding inhibitors of MMP13[J]. Bioorganic Med Chem Lett,2011,14:1215-1219.

2013-07-01

2013-10-09

1001-6325(2014)04-0548-02

R 735

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