苯丙酸諾龍促進胰島NIT-1細胞Nampt表達和胰島素分泌

陳潔潤，吳雅婷，馮 喬，沈 旺，馮樂平

(桂林醫學院 生物技術學院， 廣西 桂林 541004)

研究論文

苯丙酸諾龍促進胰島NIT-1細胞Nampt表達和胰島素分泌

陳潔潤，吳雅婷，馮 喬，沈 旺，馮樂平*

(桂林醫學院 生物技術學院， 廣西 桂林 541004)

目的探討雄性激素苯丙酸諾龍在氧化應激條件下對胰島細胞的作用，為2型糖尿病治療提供理論依據。方法將培養的NIT-1細胞按不同葡萄糖濃度(5.6、11.1、16.7和27.6 mmol/L)分為4組，分別用10 μg/mL苯丙酸諾龍處理48 h，之后用流式細胞儀檢測細胞周期；用Western blot 檢測Nampt和FOXO1蛋白表達和用放射免疫法測定細胞胰島素分泌。結果用苯丙酸諾龍處理48 h后，1)低糖條件下細胞G0/G1期阻滯明顯改善(Plt;0.01)；2)高糖條件下細胞G2/M期阻滯得到緩解(Plt;0.01)；3)高糖氧化應激狀態下，苯丙酸諾龍促進胰島細胞Nampt表達(Plt;0.05)和抑制非磷酸化的FOXO1蛋白表達(Plt;0.01)，細胞分泌胰島素增加。結論苯丙酸諾龍能夠在高濃度葡萄糖條件下改善胰島細胞生存狀況和促進胰島素分泌，這些效應可能與促進細胞內Nampt表達和抑制FOXO1密切相關。

胰島NIT-1細胞； 苯丙酸諾龍； Nampt； FOXO1; 細胞周期

最近研究表明，睪丸激素缺乏能夠降低組織胰島素受體表達和減少葡萄糖氧化，然而這種機制并不明確[1]。去勢大鼠給予一定的睪丸酮可以改善上述狀況，說明男性性激素水平改變與胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關[2-3]。由此可以推斷，雄激素可能與胰島素信號傳導途徑存在密切聯系。本研究應用苯丙酸諾龍作用小鼠胰島NIT-1細胞株，觀察雄激素苯丙酸諾龍對NIT-1細胞內煙酰胺磷酸核糖轉移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt)和叉頭轉錄因子(forkhead box protein 1, FOXO1)表達的關系，探討雄性激素對胰島細胞的作用，試圖揭示2型糖尿病中的胰島β細胞在胰島素抵抗過程中的發病機理，為糖尿病治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株

胰島β細胞株NIT-1細胞(華中科技大學同濟醫學院附屬醫院內分泌實驗室饋贈)。

1.2 主要試劑

DMEM培養基、RPMI-1640培養基(Hyclone公司)，苯丙酸諾龍、碘化丙啶PI(Sigma公司)，碘-胰島素放射免疫分析藥盒(北京北方生物技術研究所)，WIP組織細胞裂解液、superECL plus western blot超敏發光液(北京博奧森生物技術有限公司)，Nampt和FoxO1兔抗鼠多克隆一抗、Actin抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗IgG(H+L)-HRP(Bioworld Technology公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 NIT-1細胞的培養與分組：取4×105/L的NIT-1細胞放于直徑3.5 mm平皿中(含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640完全培養基)，置37 ℃、含5% CO2細胞培養箱培養。取增殖期細胞依照培養基不同糖濃度分為以下4組：分別為5.6 mmol/L(低糖)，11.1 mmol/L(對照組)，16.7和27.6 mmol/L(高糖組),每個糖濃度組分別設置5復孔。

1.3.2 蛋白質印跡法檢測Nampt和FOXO1蛋白表達：各不同濃度葡萄糖處理組的NIT-1細胞經預冷的PBS(pH 7.4)漂洗后，加入預冷RIPA裂解液，將刮取的貼壁細胞和裂解液混合后轉移至預冷微量離心管中，超聲波處理30～60 s，4 ℃搖動30 min后12 000 r/min離心15 min，收集各組上清液測定總蛋白濃度(BCA蛋白定量試劑盒，按說明書操作)。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質后，于4 ℃冰箱中80 mV轉PVDF膜1 h，常溫下封閉膜2 h，分別應用一抗β-actin抗體(1∶1 000)，Nampt抗體(1∶500)、FOXO1抗體(1∶500)，按1∶200～500比例加入5%疊氮鈉(4 ℃輕搖過夜), 之后應用相應二抗(羊抗兔IgGHRP, SantaCruz公司產品)稀釋液37 ℃孵育1 h。將化學發光底物(按1∶1 混勻)加于PVDF膜上，應用Quantity One成像系統(Bio-Rad公司)檢測靶蛋白和β-action雜交圖像的峰面積值，以兩者峰面積值比表示蛋白表達量(重復3次取平均值)。蛋白表達水平(相對值)=待測蛋白吸光度值/β-actin吸光度值。

1.3.3 流式細胞術PI染色法檢測細胞周期：取細胞加入1 mL PBS懸浮細胞洗滌細胞，隨渦旋振蕩緩慢滴加9 mL 70%冰乙醇固定細胞，1 000 r/min離心10 min后棄冰乙醇，PBS洗滌后，應用0.5 mL的100 mg/L的RNase懸浮細胞，置37 ℃水浴箱中孵育30 min，加入25 μL 1g/L PI染液，避光染色3～5 min后流式細胞儀檢測細胞周期。軟件分別計算G1/G0期、S期和G2/M期細胞百分數及細胞增殖指數PI=(S期+G2/M期)/(G1/G0期+ S期+G2/M期)。

1.3.4 放射免疫法檢測胰島NIT-1細胞分泌的胰島素：應用苯丙酸諾龍干預48 h后，收集細胞上清液到EP管中置于室溫，根據胰島素檢測試劑盒要求(具體步驟參見說明書)。應用GC-1200型γ放射免疫計數器(中佳光電儀器分公司)進行計數，參考標準曲線計算出細胞樣品上清液中胰島素濃度。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 Western blot法檢測NIT-1細胞中Nampt和FOXO1蛋白表達

在5.6和27.6 mmol/L葡萄糖條件下，Nampt蛋白表達均降低，而FOXO1蛋白隨葡萄糖增加表達升高。苯丙酸諾龍干預后，細胞Nampt表達均增加，高濃度葡萄糖培養時，Nampt蛋白表達較對照組增加明顯(Plt;0.01)(圖1)；FOXO1表達較對照組均明顯減少(Plt;0.01)，當葡萄糖≤11.1 mmol/L時，FOXO1表達較對照組減少(Plt;0.05)(圖2)。

*Plt;0.01 compared with control圖1 苯丙酸諾龍干預48 h后各組NIT-1細胞Nampt蛋白表達Fig 1 Nampt expression of NIT-1 cells after nandro- lone phenylpropionate intervened 48 hours

2.2 流式細胞術PI染色法檢測NIT-1細胞周期

當葡萄糖5.6 mmo/L時，NIT-1 細胞出現G0/G1期阻滯；當葡萄糖分別在16.7和27.6 mmol/L時，細胞在G2/M期出現阻滯，苯丙酸諾龍干預后，G2/M期阻滯狀態均明顯改善(Plt;0.05，Plt;0.01)(表1)，而這種作用在低糖時并不明顯。

*Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with control圖2 苯丙酸諾龍干預48 h各組NIT-1細胞FOXO1蛋白表達Fig 2 FOXO1 expression of NIT-1 cells after nandro- lone phenylpropionate intervened 48 hours

2.3 放射免疫法檢測胰島NIT-1細胞的胰島素分泌水平

當葡萄糖在5.6和11.1 mmo/L時，苯丙酸諾龍干預后未見胰島素分泌明顯改變；但當葡萄糖增加到16.7 mmo/L之后，苯丙酸諾龍干預使細胞胰島素分泌明顯增加(Plt;0.01)(表2)。

3 討論

很多疾病由于類固醇激素變化嚴重影響了機體外周胰島素抵抗狀態[4]。然而，雄性激素影響胰島β細胞分泌胰島素的作用機制目前所知甚少。本研究采用高濃度葡萄糖作用胰島細胞，模擬糖尿病條件下胰島細胞可能受到的沖擊，之后應用10 μg/mL苯丙酸諾龍對不同糖濃度培養的NIT-1細胞進行干預。結果發現，當細胞處于饑餓狀態，細胞被阻滯在G0/G1期，而在高糖氧化應激時細胞被阻滯在G2/M期，低糖和高糖狀態均明顯導致NIT-1細胞增殖指數降低。應用苯丙酸諾龍干預后，細胞所發生的阻滯效應均被解除，細胞增殖指數也明顯增加。Western blot結果發現，在低糖和高糖培養時，Nampt蛋白表達均明顯降低，且隨著葡萄糖濃度在≥16.7 mmol/L時，FOXO1蛋白表達增高。應用苯丙酸諾龍干預48 h后，上述兩種條件中的細胞Nampt表達均明顯增加，此時FOXO1蛋白表達則明顯減少。研究表明，Nampt能夠通過介導NAD的生物合成激活SIRT1，并且在介導NAD生物合成過程中調節胰島β細胞分泌胰島素[5]。在胰島素抵抗過程中，FOXO1不能被Akt磷酸化從胞核排出而積聚在核內，從而促進細胞糖脂代謝紊亂[6-7]，本研究發現，應用苯丙酸諾龍能夠在提高NIT-1細胞Nampt表達的同時，抑制非磷酸化的FOXO1表達。由此可見，苯丙酸諾龍既能夠增強Nampt表達，又能夠抑制FOXO1的轉錄活性，然而苯丙酸諾龍的這種作用是否是在影響了Nampt表達之后，才對胰島素信號途徑發揮作用，還是直接作用了胰島素信號途徑尚待進一步研究。

表1 苯丙酸諾龍干預后各組 NIT-1 細胞周期中G0/G1期和G2/M期變化

*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with control.

表2 不同糖濃度條件下苯丙酸諾龍干預后細胞分泌胰島素情況

*Plt;0.01 compared with control.

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Benzyl propionate nandrolone enhancesNampt expression and insulin secretion in NIT-1 islet cells

CHEN Jie-run,WU Ya-ting,FENG Qiao,SHEN Wang, FENG Le-ping*

(Dept. of Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin 541004, China)

ObjectiveTo discuss the effects of nandrolone styrene acrylic acid on islet cells under the condition of oxidative stress for the theoretical basis of the treatment of type 2 diabetes.MethodsNIT-1 cell were divided into four groups with different concentrations of glucose (5.6,11.1,16.7 and 27.6 mmol/L),then treat with 10 μg/mL Benzyl propionate nandrolone for 48 h. Nampt and FOXO1 protein expression was detected by Western blot assay. Cell cycle was determined by FCM and cell insulin secreted level was measured with radioimmuno-assay.ResultsTreated with benzyl propionate nandrolone for 48 h,1) G0/G1phase retardation effect of the cell cycle was relieved(Plt;0.01)when the cell cultured in lower energy, but 2) G2/M block effect of the cell significantly remitted(Plt;0.01) under the condition of high glucose concentration. 3) Benzyl propionate nandrolone can promote Nampt protein expression(Plt;0.05) and promoted insulin secretion, inhibiting the dephosphorylated FOXO1 expression(Plt;0.01).ConclusionBenzyl propionate nandrolone would promote islet NIT-1 cell proliferation and insulin se-cretion. These effects are closely related to the inhibition of FOXO1 inhibit of FOXO1 through Nampt increase.

pancreatic islet cell; benzyl propionate nandrolone; Nampt; FOXO1; cell cycle

2013-10-08

2013-11-15

國家自然科學基金(30860116, 31060161)；廣西科技廳科研基金(桂科自0728230)；廣西教育廳2013年自治區大學生創新創業訓練計劃立項項目〔桂教高教(2013)14號〕；廣西教育廳科研資助課題〔桂教科研(2010)10號, 201010LX325，201010LX326〕

*通信作者(correspondingauthor): lpfeng1226@sina.com

1001-6325(2014)01-0068-04

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