N-乙酰半胱氨酸減輕香煙煙霧提取物所致的A549細胞損傷

張強弩，焦宗憲，常嘉琛

(蘭州大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 病理學研究所， 甘肅 蘭州 730000)

研究論文

N-乙酰半胱氨酸減輕香煙煙霧提取物所致的A549細胞損傷

張強弩，焦宗憲*，常嘉琛

(蘭州大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 病理學研究所， 甘肅 蘭州 730000)

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)對香煙煙霧提取物(CSE)暴露后的A549細胞的影響。方法MTT法測定不同處理后A549細胞的存活率；用PI單染和AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細胞的周期變化和凋亡變化；用熒光探針H2DCFDA檢測細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)變化；用實時熒光定量PCR和Western blot 技術(shù)檢測胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)的表達變化。結(jié)果CSE致A549細胞存活的A值為0.55±0.04，顯著低于對照組的0.78±0.03(Plt;0.05)，NAC處理使A值顯著上升至0.67±0.04(Plt;0.05)，并消除了G1期阻滯，降低細胞凋亡率等。IGFBP-3的表達在CSE刺激后，有所升高，在接受NAC保護后，其表達水平有所降低(Plt;0.05)。結(jié)論NAC可以抑制香煙煙霧提取物造成的A549細胞損傷，IGFBP-3可能在香煙煙霧提取導致細胞損傷的機制中發(fā)揮作用。

IGFBP-3；香煙煙霧提取物；肺泡上皮細胞；N-乙酰半胱氨酸

香煙煙霧可以引發(fā)氧化應激，對肺泡上皮細胞造成損傷[1],此過程涉及細胞增殖障礙但其具體機制尚未清楚[2]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)與細胞的增殖密切相關(guān)[3]。高氧暴露后，IGFBP的表達發(fā)生變化[4]。氧化應激造成細胞損傷的機制也可能與IGFBP有關(guān)。IGFBP-3是IGFBP家族的重要的成員，故本研究用香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)對A549細胞進行刺激，然后分析IGFBP-3表達水平的變化，以期找到兩者的聯(lián)系。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine，NAC)是一種效果明確的抗氧化劑[5]。但具體來講，NAC是否可以從細胞周期阻滯，降細胞凋亡等方面，改善CSE導致的肺泡上皮細胞細胞損傷，還有待驗證。因此本研究假設(shè)NAC可以從多角度對抗CSE來源的氧化應激對細胞造成的損傷，同時會影響IGFBP-3在損傷中的表達水平。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

A549細胞系(中國科學院上海生命科學研究所)。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)MTT試劑，Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒和DCFH-DA熒光探針(Sigma公司)RIPA裂解液和BCA蛋白定量分析盒(北京普利萊生物技術(shù)公司)，小鼠抗人IGFBP-3多克隆抗體和小鼠抗人ACTB多克隆抗體(Abcam公司)RNAiso Plus Kit，PrimeScript? RTreagent Kit和SYBR? Premix EX TaqⅡ[寶生物工程(大連)有限公司)]。Dy-Light 800 紅外二抗(KPL實驗技術(shù)公司)

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將A549細胞置于37 ℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞消化采用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶。選取對數(shù)期細胞進行實驗。細胞分為對照組，單純CSE處理組和CSE+NAC處理組，詳細分組如下所述，每組設(shè)5個平行樣本。

1.3 香煙煙霧提取物的制備

使用本研究組自行開發(fā)設(shè)計的CSE系統(tǒng)制備CSE，將3支香煙產(chǎn)生的主流煙霧溶于20 mL無血清DMEM培養(yǎng)基中，保證充分吸收。調(diào)整此溶液的pH至7.5，使用0.22 μm孔徑的濾器過濾除菌。設(shè)定此溶液為濃度100% CSE，在隨后實驗中用DMEM培養(yǎng)基稀釋使用，保證該CSE在制備30 min內(nèi)使用。

1.4 MTT法分析細胞存活率

制備細胞懸液，以1.5×105/mL接種入96孔板，每孔150 μL。于37 ℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后，無血清DMEM處理16 h。隨后細胞分為9組，1組為對照組，不做藥物處理。其中4組直接暴露于：5%、10%、20%和30% CSE。另外4組加入1 mmol/L NAC后再暴露于上述濃度的CSE中。每組設(shè)5個平行孔，另外設(shè)調(diào)零孔。加入MTT后用Biotek elx800酶標儀，測定各孔在490 nm處的吸光度。

1.5 細胞周期分析

根據(jù)MTT分析的結(jié)果，選用20% CSE做后續(xù)研究較為適宜。將A549細胞以2×106個/孔種植于6孔板，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，將細胞分為3組：對照組，20% CSE處理組，20% CSE+1 mmol/L NAC組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細胞。使用預冷的冰PBS洗滌細胞，然后使用70%預冷乙醇，4 ℃固定12 h。接著，使用PBS再次洗滌細胞，加入50 mg/L碘化丙啶(PI)500 μL，4 ℃避光染色30 min。隨后，使用流式細胞儀(BD FASCCalibur system)分析細胞周期。

1.6 細胞凋亡

細胞的分組處理同上。處理完成后收集細胞，使用預冷冰PBS洗滌細胞，離心后使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒中提供的重懸緩沖液500 μL重懸浮細胞。依次加入5 μL Annexin V以及10 μL PI，常溫避光靜置10 min后，使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.7 細胞內(nèi)ROS水平的測定

細胞的處理和分組方法同上，收集處理后的細胞，使用無血清DMEM洗滌細胞，接著加入10 μmol/L DCFH-DA探針，在37 ℃孵育30 min。使用熒光分光光度計(RT-970)檢測細胞內(nèi)熒光水平。激發(fā)波長設(shè)為485 nm，發(fā)射波長設(shè)為533 nm。

1.8 實時熒光定量PCR 檢測IGFBP-3 的mRNA水平變化

細胞分組處理同上，處理后使用RNA iso裂解試劑提取每孔細胞的RNA。使用核酸蛋白儀驗證提取產(chǎn)物的濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄體系為：5×PrimeScript 緩沖液2.0 μL，PrimeScript Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μL，Oligo引物0.5 μL，隨機引物0.5 μL，RNA模板1.0 μL，無酶滅菌水5.5 μL。反應條件為：1)37 ℃ 15 min； 2)85 ℃ 5 s。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒對上述合成的cDNA進行PCR擴增。

IGFBP-3 的上游引物為：5′-CAGCCAGCGCGCT ACAAGTTGACTA-3′,ACTB下游下游引物為：5′-CT GGGACTCAGCACATTGAGGA-3′,β-actin的上游引物為：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,下游引物為：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。反應體系：SYBR Premix EX Taq Ⅱ 10.0 μL，上游引物和下游引物各0.8 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌蒸餾水6.4 μL。反應步驟為：1)95 ℃ 持續(xù)30 s，循環(huán)1次； 2)95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。反應在MJ research公司的PTC-200 PCR儀中進行。使用Rotor gene 6軟件查看分析反應結(jié)果，使用2-△△CT法分各樣本的IGFBP-3的相對表達情況。

1.9 Western blot檢測IGFBP-3的蛋白水平變化

分組處理同前， RIPA蛋白裂解液(500 μL/孔)提取蛋白，用BCA蛋白定量分析盒定量，確保每孔上樣量為30 μg。使用12%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電壓為120 V，時間為2 h。隨后在冰浴中進行轉(zhuǎn)膜，使用PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒流250 mA，時間為1.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別使用小鼠抗人IGFBP-3抗體(1∶500)與小鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育12 h。接著使用PBST洗滌3次，除去未結(jié)合的一抗。使用Dy-Light 800紅外標記的二抗避光孵育膜2 h，隨后使用PBST洗滌3次，除去多余二抗，利用Odyssey遠紅外呈像系統(tǒng)分析蛋白條帶。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 NAC可以抵抗香煙煙霧提取物造成的細胞損傷

CSE呈劑量依賴關(guān)系對A549造成殺傷，減低細胞的存活率。加入1 mmol/L NAC后，與單純CSE刺激相比，細胞存活率有所上升(Plt;0.05)(圖1)。

*Plt;0.05 compared with group without NAC treatment 圖1 CSE和NAC對A549細胞存活率的影響Fig 1 Cell viability in A549 cells after treatment with CSE and NAC

2.2 細胞周期

對照組的G1期百分比為42.35%±2.41%，G2期百分比為17.25%±0.66%(n=3).對于20%CSE處理組來說，G1期百分比為66.59%±6.95%，G2期百分比為6.19%±4.90%。同時20% CSE+NAC組的G1期百分比為53.14±9.34%，G2期百分比為12.38%±3.92%。各組間相比(Plt;0.05)(圖2)。

2.3 細胞凋亡分析

對細胞進行凋亡分析發(fā)現(xiàn)，20% CSE處理后，細胞的總凋亡率為35.83%±2.56%(右上象限+右下象限)顯著高于照組的總調(diào)亡率4.08%±1.89%(Plt;0.05，n=3)。加入NAC后，細胞總調(diào)亡率降至28.51%±2.26%(Plt;0.05)(圖3)。

2.4 細胞內(nèi)ROS水平分析

20% CSE組的ROS水平有所上升，加入NAC后，ROS水平下降，各組間(Plt;0.05，n=3)(圖4)

圖2 CSE和NAC處理后細胞周期的變化Fig 2 Cell cycle analysis by flow cytometric after CSE and NAC treatment

圖3 CSE和NAC處理后的細胞凋亡率Fig 3 Values for cell cycle and cell apoptosis by flow cytometric analysis after CSE and NAC treatment

*Plt;0.05 compared with normal control group； #Plt;0.05 compared with 20% CSE group圖4 CSE和NAC處理后細胞內(nèi)的ROS水平Fig 4 Intracellular ROS level change after treated with CSE and NAC

2.5 IGFBP-3表達水平的變化

CSE刺激細胞后， IGFBP-3表達水平顯著高于對照組(Plt;0.05)，加入NAC后，IGFBP-3的表達水平有所回降但仍高于對照組(Plt;0.05)(圖5,6)。

*Plt;0.05 compared with normal control group； #Plt;0.05 compared with 20% CSE group圖5 CSE和NAC處理后IGFBP-3 mRNA水平的相對倍數(shù)變化Fig 5 Relative fold changes of IGFBP-3 mRNA after CSE or SFN treatment

*Plt;0.05 compared with normal control group； #Plt;0.05 compared with 20% CSE group圖6 CSE和NAC處理后IGFBP-3蛋白表達水平的變化Fig 6 IGFBP-3 protein expression after treated with CSE and NAC

3 討論

香煙煙霧損傷肺泡的機制之一就是引起氧化應激，進而阻礙細胞增殖，引發(fā)凋亡或者壞死。本研究發(fā)現(xiàn)，CSE可以誘導A549細胞的凋亡，造成G1期阻滯，提高細胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，從而導致A549細胞存活率降低，出現(xiàn)增殖障礙。而使用NAC處理細胞后， 細胞凋亡與周期阻滯等不良后果明顯得到緩解。結(jié)果提示，NAC的確可以抵抗CSE對肺泡上皮細胞的損傷，所以NAC也許可以作為治療預防慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的藥物。但是，香煙煙霧對肺組織的損傷不僅限于對肺泡上皮細胞的殺傷，除了抗氧化，抑制凋亡，NAC是否其他方面的保護作用也值得進一步研究。比如有結(jié)果表明，香煙煙霧還可以引起肺組織的纖維化[6]，NAC是否可以緩解香煙煙霧造成的纖維化，還不得而知，可在未來實驗中再行研究。研究中使用CSE刺激A549細胞，發(fā)現(xiàn)A549出現(xiàn)了生長抑制和凋亡等現(xiàn)象，同時伴有IGFBP-3表達的增高。在使用NAC預處理細胞后，經(jīng)過同樣濃度的CSE處理，細胞的凋亡不再那么明顯，同時也沒有觀察到IGFBP-3的高表達。這個結(jié)果暗示，IGFBP-3可能在CSE誘導的細胞損傷中起著促進凋亡的作用。

IGFBP-3 促進細胞凋亡的機制涉及依賴IGF-1途徑以及非依賴IGF-1途徑。前者認為，IGFBP-3可以與IGF-1特異性結(jié)合，這樣與IGF-1受體結(jié)合的IGF-1被減少，活性被抑制，細胞由于缺少IGF-1，因而生長受限，出現(xiàn)凋亡[7]。后者認為IGFBP-3發(fā)揮凋亡作用還與其他一些凋亡調(diào)控因子有關(guān)。如有研究表明，IGFBP-3可以抑制NF-κB的活性，后者具有抑制凋亡的作用[8]。IGFBP-3也與MAPK通路有關(guān)[9]，有研究表明，IGFBP-3可以加強TGF-β1誘導的MAPK通路成員P38的活化，從增加細胞凋亡[10]。除此之外，IGFBP-3和很多其他的凋亡調(diào)控因子相關(guān)，比如BAX，BAD等[11]。在香煙煙霧的刺激中，IGFBP-3是如何發(fā)揮作用的還有待進一步的研究。現(xiàn)有研究只發(fā)現(xiàn)香煙煙霧造成的細胞損傷伴隨有IGFBP-3的表達增高，后續(xù)研究可使用siRNA干擾技術(shù)，降低IGFBP-3的表達，再使用CSE進行刺激，然后觀察細胞的損傷是否有所減輕從而進一步揭示香煙煙霧引發(fā)細胞凋亡的機制。

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NAC relieves the A549 cells injury induced by cigarette smoke extract

ZHANG Qiang-nu, JIAO Zong-xian*,CHANG Jia-chen

(Institute of Pathology，School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)

ObjectiveTo study the protective role of N-acetylsteine in the A549 cell injury caused by cigarette smoke exact and the expression change of insulin-like growth factor binding protein -3 in this process.MethodsMTT assay was used to evaluate cell viability. Cell cycle and apoptotic cell proportion in each group detected respectively by PI and AnnexinV-FITC/PI double-labelled flow cytometry. Intracellular reactive oxygen species (ROS) was estimated by fluorescent indicator H2DCFDA. DAPI was used to observe the nuclear morphology. Furthermore, using real-time quantitative RT-PCR as well as western blot methods,the expression level of IGFBP-3 was detected.ResultsCompared with control group(0.78±0.03), CSE inhibit cell proliferation significantly(0.55±0.04). NAC can reduce cell injury caused by CSE including restoring the viability of A549 cells(0.67±0.04), attenuating G1block of cell cycle and significantly reducing the proportion of apoptotic cells and so on. High expression of insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) in A549 cells treated with CSE was found at both transcriptional and protein levels, and concomitant with the restoration of cell growth after treatment with NAC, down regulation of IGFBP-3 was observed.ConclusionsIt is concluded that NAC can antagonize CSE-induced growth arrest of alveolar epithelial cells and that down regulated IGFBP-3, which probably play an important role in this process.

IGFBP-3; cigarette smoke extract; alveolar epithelial cells; NAC

2013-01-21

2013-05-19

蘭州大學中央高校基本科研業(yè)務費專項資金(lzujbky-2009-92,lzujbky-2013-223)

*通信作者(correspondingauthor)：jiaozongx@lzu.edu.cn

1001-6325(2014)01-0072-06

R 365

A