EMD-PLGA NPs延緩5/6腎切除大鼠誘發(fā)慢性腎功能衰竭

徐 麗，關(guān)鳳軍，董 晨，高莉莉，謝海濤，孫曉華

(徐州醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 兒科, 江蘇 徐州 221000)

EMD-PLGA NPs延緩5/6腎切除大鼠誘發(fā)慢性腎功能衰竭

徐 麗#，關(guān)鳳軍*，董 晨，高莉莉，謝海濤，孫曉華

(徐州醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 兒科, 江蘇 徐州 221000)

目的探討大黃素-聚乳酸/羥基乙酸共聚物納米粒(EMD-PLGA NPs)對5/6腎切除大鼠殘余腎組織的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。方法大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組8只(sham組)，造模成功24只后隨機(jī)分為模型組8只(model組)、大黃素組8只(EMD組)、納米粒組8只(NPs組)，期間檢測大鼠24 h尿蛋白定量、血尿素氮(BUN)和血肌酐(SCr)，光鏡下觀察腎組織病理變化，分別用RT-PCR法和免疫組織化學(xué)法檢測腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)及結(jié)締組織生長因子(CTGF)mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果藥物干預(yù)后，與sham組比較，model組24 h尿蛋白定量、BUN、SCr及TGF-β1和CTGF mRNA及蛋白水平上升(Plt;0.01)；與model組比較，EMD組、NPs組24 h尿蛋白定量、BUN、SCr、TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白水平下降(Plt;0.01)；與EMD組比較，NPs組24 h尿蛋白定量、BUN、SCr、TGF-β1和CTGF mRNA及蛋白水平下降(Plt;0.01)。結(jié)論與普通EMD比較，EMD-PLGA NPs能更好地延緩腎病慢性進(jìn)展。

大黃素；聚乳酸/羥基乙酸；納米粒；5/6腎切除；慢性腎功能衰竭

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure,CRF)是各種腎臟疾病晚期的共同歸宿，是特征的臨床綜合群。各種慢性腎臟疾病最終均表現(xiàn)為腎臟纖維化而失去正常功能。大黃素(emodin,EMD)明確具有抗腎纖維化的作用[1-2]，但其水溶性差，不利于注射給藥，且進(jìn)入體內(nèi)后會在短時(shí)間內(nèi)大量釋放，口服給藥吸收速率、吸收度都很低，影響藥物作用。納米粒(nanoparticles,NPs)具有增加藥物的溶解度，改善藥物的吸收和提高生物利用度，改變藥物的藥動學(xué)性質(zhì)，強(qiáng)的穿透組織間隙等多種作用提高藥物療效[3]。但是尚未有研究將EMD和NPs結(jié)合在一起干預(yù)慢性腎功能衰竭，納米?？梢詮浹a(bǔ)EMD水溶性差等缺陷，將EMD微囊化，理論上可提高其在腎臟中的血藥濃度與半衰期?；诖?，大黃素-納米粒(emodin-polylactic-co-glycolic acid nanoparticles,EMD-PLGA NPs)特別適用于慢性腎病的治療。本研究用乳化溶劑揮發(fā)法制備EMD-PLGA NPs[4]，進(jìn)一步研究EMD-PLGA NPs對大鼠腎臟大部分切除后殘余腎單位的功能、病理損害、纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量180～230 g，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號[SCXK(蘇)2003-0003]。

1.2 模型制備、分組

大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按照隨機(jī)抽簽法，8只為sham組：僅將腎周脂肪鈍性分離，注意保護(hù)腎上腺。24只用兩步法成功制備5/6腎臟切除致CRF模型[5-7]，造模1周后將大鼠隨機(jī)均分成3組， 即model組、EMD組和NPs組。

1.3 藥物配制及給藥

EMD標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%，批號512-82-1，徐州市博士達(dá)科技有限公司)；羧甲纖維素鈉(批號F20110110，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；EMD-PLGA NPs制備：是通過乳化溶劑揮發(fā)法制備的，通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化處方，在最佳條件下制得納米粒呈圓球狀或橢圓狀；粒徑約(100±50)nm左右；分散體系的顆粒由上而下呈逐漸變淡的彌散分布，無明顯的沉積物，載藥量為(18.5±3.7)%。

所有受試藥物均用羧甲基纖維素鈉配制成混懸液。EMD水溶性較差，但可溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉。第2次手術(shù)后1周開始灌胃給藥8周，sham組、model組予0.5%羧甲基纖維素鈉。EMD組給藥EMD 40 mg/(kg·d)。NPs組 EMD-PLGA NPs 216.477 mg/(kg·d)。

1.4 主要試劑和儀器設(shè)備

血肌酐試劑盒和血尿素氮試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TGF-β1多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；CTGF多克隆抗體和二抗(北京中杉金橋生物有限公司)。

1.5 觀察指標(biāo)和標(biāo)本采集

1.5.1 尿蛋白定量：每2周測1次，給藥前(第2次手術(shù)后1周)，給藥2、4、6和8周分別將大鼠置于代謝籠收集24 h尿液，收集尿液期間禁食但自由飲水。用磺基水楊酸比濁法測定24 h尿蛋白定量。

1.5.2 血BUN、SCr：給藥前和給藥4周從內(nèi)眥取血2 mL，實(shí)驗(yàn)終止時(shí)注入10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，從腹主動脈取血2 mL。采血前大鼠禁食8 h。用血尿素氮、肌酐試劑盒進(jìn)行測定。

1.5.3 HE染色：分離左側(cè)殘腎，將1/2殘腎切成若干小塊液氮凍存，以備檢測TGF-β1、CTGF。剩余腎組織以多聚甲醛固定脫水、浸蠟、包埋、切片做常規(guī)病理HE染色，HE染色行光學(xué)顯微鏡檢查。

1.5.4 免疫組織化學(xué)染色：采用PV法，PBS代替一抗作為陰性對照染色，檢測TGF-β1、CTGF的表達(dá)。

1.5.5 半定量RT-PCR：Trizol法提取腎組織總RNA，2 μg RNA行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s；54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次后，最后72 ℃延伸5 min。引物由上海生物工程有限公司合成，TGF-β1:β-actin引物：上游5′-CCAAAAGGGTCATCATCTCC-3′，下游5′-CAACCTGGTCCTCAGTGTAGC-3′擴(kuò)增產(chǎn)物長度為499 bp；TGF-β1引物：上游5′-GAACCAAGGAG ACGGAATACAG-3′，下游5′-AACCCAGGTCCTTCCT AAAGTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為298 bp。CTGF:β-actin引物：上游5′-GACCTTCAACACCCCAGCCA-3′，下游5′-GTCACGCACGTTTCCCTCTC-3′擴(kuò)增產(chǎn)物長度為258 bp；CTGF引物：上游5′-GCGTAAAGCCAGGGA GTA-3′，下游5′-AGCAGTTAGGAACCCAGATT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為133 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像并用計(jì)算機(jī)圖像信號分析，結(jié)果以目的片段與β-actin片段的條帶吸光度的比值作半定量比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尿蛋白定量的變化

1周后5/6腎切除大鼠尿蛋白定量較sham組有所升高(Plt;0.01)。EMD組和NPs組尿蛋白定量顯著低于model組(Plt;0.01)；NPs組尿蛋白定量顯著低于EMD組(Plt;0.01)(表1)。

2.2 各組大鼠血BUN、SCr的比較

1周后5/6腎切除大鼠BUN、SCr 明顯高于sham組(Plt; 0.01)。干預(yù)4周、8周，EMD組、NPs組BUN、SCr顯著低于model組(Plt; 0.01)，干預(yù)組BUN、SCr升高趨勢較model組明顯緩慢；NPs組BUN、SCr顯著低于EMD組(Plt;0.01)(表2)。

2.3 各組大鼠腎臟組織學(xué)改變

2.3.1 各組大鼠腎組織HE染色：sham組大鼠腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。Model組腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，系膜增生較嚴(yán)重，呈彌漫性硬化、纖維化，腎小管管腔擴(kuò)張明顯，可見蛋白管型，部分腎小管上皮細(xì)胞濁腫，腎間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化明顯。EMD組部分腎小球毛細(xì)血管襻呈分葉狀，呈局灶節(jié)段性硬化，腎小球系膜輕度增生，部分腎小管管腔擴(kuò)張，未見蛋白管型，間質(zhì)見炎性細(xì)胞浸潤。NPs組腎小球病變較輕微，系膜輕度增生，腎小球硬化不明顯，未見球囊粘連，腎小管輕度擴(kuò)張，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤(圖1)。

表1 各組大鼠尿蛋白定量變化Table 1 Urine protein in different groups(±s, mg/24 h,n=8)

△Plt;0.01 compared with sham group；*Plt;0.01 compared with model group；#Plt;0.01 compared with EMD group.

表2 各大鼠血BUN、SCr變化Table 2 BUN, SCr in different groups(±s, n=8)

△Plt;0.01 compared with sham group；*Plt;0.01 compared with model group；#Plt;0.01 compared with EMD group.

2.3.2 各組大鼠免疫組織化學(xué)染色的比較：sham組大鼠腎組織TGF-β1、CTGF呈弱表達(dá)，model組TGF-β1、CTGF免疫染色強(qiáng)度和面積明顯增加，EMD組、NPs組依次減弱(圖2，3)。與sham組比較，model組TGF-β1、CTGF表達(dá)上調(diào)(Plt;0.01)；與model組比較，EMD組、NPs組TGF-β1、CTGF表達(dá)下調(diào)(Plt;0.01)；與EMD組比較，NPs組TGF-β1、CTGF下調(diào)(Plt;0.01)(表3)。

2.3.3 TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA的表達(dá)：給藥干預(yù)8周后，各組大鼠腎組織TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA灰度值比較結(jié)果顯示：與sham組比較，model組TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA表達(dá)上調(diào)(Plt;0.01)；與model組比較，EMD組、NPs組TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA表達(dá)下調(diào)(Plt;0.01)；與EMD組比較，NPs組TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA表達(dá)下調(diào)(Plt;0.01)(圖4，5;表4)。

A.sham group；B.model group；C.EMD group；D.NPs group圖1 各組大鼠腎組織Fig 1 The renal tissue in different groups(×400)

A.sham group；B.model group；C.EMD group；D.NPs group圖2 各組大鼠TGF-β1免疫組化表達(dá)Fig 2 Expression of TGF-beta 1 immunohistochemical in different groups(×400)

A.sham group；B.model group；C.EMD group；D.NPs group圖3 各組大鼠CTGF免疫組化表達(dá)Fig 3 Expression of CTGF immunohistochemical in different groups(×400)

表3 各組大鼠TGF-β1、CTGF A值比較Table 3 Comparison of TGF-beta 1, CTGF A value

△Plt;0.01 compared with sham group；*Plt;0.01 compared with model group；#Plt;0.01 compared with EMD group.

1.sham group；2.model group；3.EMD group；4.NPs group圖4 各組別大鼠TGF-β1 mRNA表達(dá)Fig 4 Expression of TGF-beta 1 mRNA in different groups

1.sham group；2.Model group；3.EMD group；4.NPs group圖5 各組別大鼠CTGFmRNA表達(dá)Fig 5 Expression of CTGF mRNA in different groups

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠TGF-β1、CTGF mRNA表達(dá)比較Table 4 Comparison of TGF-beta 1, CTGF mRNA

△Plt;0.01 compared with sham group；*Plt;0.01 compared with model group；#Plt;0.01 compared with EMD group.

3 討論

目前國內(nèi)外尚無可完全控制CRF的進(jìn)展最理想的藥物，針對CRF病變慢性進(jìn)展機(jī)制及相應(yīng)的治療一直是研究的熱點(diǎn)。結(jié)合大黃素、納米粒的特點(diǎn)，EMD-PLGA NPs特別適用于慢性腎病的治療。國內(nèi)已有研究者制備了大黃素固體脂質(zhì)納米粒，并對其行大鼠體內(nèi)藥學(xué)評價(jià)[8]，但尚未進(jìn)行動物模型干預(yù)研究。

本研究采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Polylactic-Co-Glycolic Acid, PLGA)作為藥物控釋傳遞的載體。PLGA已通過美國 FDA 認(rèn)證，具有良好的生物相容性、無毒、無刺激性、無免疫原性和藥物緩釋等特性[9]。本研究成功制備PLGA大黃素納米微囊，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化處方工藝，經(jīng)過透射電鏡、激光粒度儀、紫外分光光度機(jī)等檢測，證實(shí)其具有粒徑小、水溶性好、載藥率較高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。

5/6腎切除大鼠模型病理生理學(xué)變化與CRF高度符合，且可重復(fù)性好, 被廣泛用于慢性進(jìn)展性腎病的相關(guān)研究[10-12]。TGF-β1是介導(dǎo)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化關(guān)鍵細(xì)胞因子，在腎纖維化過程中TGF-β1起著關(guān)鍵作用[13-15]。CTGF是其下游效應(yīng)因子，在正常生理時(shí)表達(dá)水平較低，生物學(xué)效應(yīng)較單一，在病理狀態(tài)時(shí)過度表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞增生和ECM在間質(zhì)沉積，從而參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展[16]。因此阻斷內(nèi)源性CTGF表達(dá)或抑制其活性可能是更特異、更有效的抗纖維化治療手段。

本研究中，model組大鼠TGF-β1、CTGF表達(dá)均明顯升高；腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，系膜增生較嚴(yán)重，腎小球呈彌漫性硬化、纖維化，腎小管管腔擴(kuò)張明顯，可見蛋白管型，部分腎小管上皮細(xì)胞濁腫，腎間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化明顯；尿蛋白量明顯增加，血尿素氮、肌酐水平升高。干預(yù)后，與普通EMD比較，NPs組上述兩種因子表達(dá)明顯降低，腎臟病理改變減輕，同時(shí)，尿蛋白量亦明顯減少，提示EMD-PLGA NPs可能通過抑制TGF-β1、CTGF的表達(dá)延緩腎臟纖維化，減輕腎臟病理改變，減少尿蛋白量，清除BUN、SCr，較普通EMD更好地發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

上述研究結(jié)果可能為拓展慢性腎臟病變防治提供新的依據(jù)。但具體機(jī)制尚不完全明確，可能與藥物半衰期延長或因藥物粒徑變小引起藥代動力學(xué)發(fā)生變化有關(guān)，可做進(jìn)一步研究，并對納米粒進(jìn)行靶向性修飾研究。

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Emodin-polylactic-co-glycolic acid NPs delays chronic renal failure by 5/6 nephrectomy

XU Li#, GUAN Feng-jun*, DONG Chen, GAO Li-li, XIE Hai-tao, SUN Xiao-hua

(1.Dept. of Pediatric, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221000,China)

ObjectiveTo explore the kidney protecting effect and possible mechanism under which the renal tissues in 5/6 nephrectomy rats was intervened by emodin-polylactic-co-glycolic acid nanoparticles.MethodsRats were randomly divided into two groups, eight as sham-operated group and twenty-four as model group. Twenty-four rats in model group were randomly and equally assigned into model group (model group), emodin group eight(EMD)and nanoparticles group eihgt (NPs). Drugs were given to rats in different groups for a total 8 weeks, then 24 h urine protein, blood urea nitrogen (BUN)and creatinine (SCr) were measured; kidney pathological changes were observed under optical microscope; protein and mRNA expression of growth factor beta-1(TGF-β1) as well as connective tissue growth factor (CTGF) in renal tissues were detected respectively by RT-PCR methods and immunohistochemistry.ResultsAfter treated with drugs,compared with sham group,24 h urine protein, blood urea nitrogen, serum creatinine, mRNA and protein expression of TGF-β1 and CTGF of rats in model group were both in-creased(Plt;0.01). Compared with model group,24 h urine protein,blood urea nitrogen,serum creatinine, mRNA and protein expression of TGF-β1 and CTGF of rats in EMD group and NPs group were both decreased(Plt;0.01);Compared with EMD group,24 h urine protein,blood urea nitrogen,serum creatinine, mRNA and protein expression of TGF-β1 and CTGF of rats in NPs group were both decreased(Plt;0.01).ConclusionsEMD-PLGA NPs inhibits renal fibrosis and slows down the progress of chronic kidney disease.

emodin;polylactic-co-glycolic acid;nanoparticles;5/6 nephrectomy;chronic renal failure

2013-04-15

2013-10-09

徐州市科技基金計(jì)劃發(fā)展項(xiàng)目(XM09B047)

#現(xiàn)工作單位：臨沂市婦幼保健院兒科

*通信作者(correspondingauthor)： guanxiaomu@sina.com

1001-6325(2014)03-0318-06

研究論文

R-332

A