高烏甲素在大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的鎮(zhèn)痛機(jī)制

肖 智，張福安，張?zhí)m英

(遵義醫(yī)學(xué)院 1.醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心； 2.第一臨床學(xué)院2009級， 貴州 遵義 563000)

高烏甲素在大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的鎮(zhèn)痛機(jī)制

肖 智1*，張福安2，張?zhí)m英2

(遵義醫(yī)學(xué)院 1.醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心； 2.第一臨床學(xué)院2009級， 貴州 遵義 563000)

目的觀察高烏甲素(LA)能否通過上調(diào)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)中P2X3受體表達(dá)和功能，對燒傷疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。方法建立Ⅱ°燒傷大鼠模型，給予腹腔注射LA 6mg/kg·24h，Von Frey測痛儀檢測機(jī)械痛閾值(MWT)；Western blot檢測P2X3受體蛋白表達(dá)；觀察干預(yù)P2X3受體蛋白的表達(dá)和功能后對LA鎮(zhèn)痛作用的影響。結(jié)果大鼠燒傷后MWT下降(Plt;0.001), 經(jīng)LA治療后MWT上升(Plt;0.001)，PAG中P2X3受體蛋白表達(dá)上調(diào)(Plt;0.001)。下調(diào)P2X3受體蛋白表達(dá)后減弱LA鎮(zhèn)痛作用；P2X3受體激動劑和拮抗劑分別增強(qiáng)和減弱LA的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)論LA通過上調(diào)PAG中P2X3受體表達(dá)和增強(qiáng)P2X3受體功能，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性鎮(zhèn)痛，對燒傷疼痛大鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

高烏甲素；燒傷疼痛；P2X3受體；中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)

高烏甲素(lappaconitine，LA)在燒傷疼痛的臨床治療中效果良好，同時(shí)LA對炎性疼痛[1]、神經(jīng)性疼痛[2]以及燒傷疼痛[3]大鼠都有很好的鎮(zhèn)痛作用，但對其鎮(zhèn)痛機(jī)制不清。中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(midbrain periaqueductal gray，PAG) 在內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)中處于核心部位。P2X3受體與疼痛的產(chǎn)生、調(diào)制密切相關(guān)。燒傷疼痛大鼠經(jīng)LA治療后，PAG中P2X3受體表達(dá)上調(diào)，說明P2X3受體介入了LA對燒傷疼痛的調(diào)制過程[3]，本研究將對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：雄性清潔級SD大鼠72只，體質(zhì)量210～220 g，由遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SYXK(黔)2011-003。在溫度(24±2)℃、濕度(60±5)%、明暗各12 h(8AM-8PM)周期環(huán)境中飼養(yǎng)，每籠5只。大鼠自由飲食及飲水。

1.1.2 試劑：山羊抗大鼠P2X3多克隆受體(Millipore公司)，96.8%氫溴酸高烏甲素(西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司)，A-317491和α,β-meATP(Sigma公司)，P2X3反義寡聚核苷酸(上海生工生物工程有限公司)，BCA蛋白測定試劑盒(Thermo公司)，化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒(BioRad公司)。

1.2 方法

1.2.1 燒傷動物模型建立與分組：72只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、燒傷組、燒傷LA組、燒傷LA+ODN、燒傷LA+A317491組和燒傷LA+ATP組，共6組(n=12)。正常組不做任何處理。燒傷建模前7 d將燒傷LA+ODN組、燒傷LA+A317491組和燒傷LA+ATP組大鼠行PAG顱內(nèi)插管。將燒傷組、燒傷LA組、燒傷LA+ODN組、燒傷LA+A317491組和燒傷LA+ATP組大鼠乙醚麻醉后大鼠右后足浸入70 ℃水中6 s，觀察燒傷創(chuàng)面有無水泡等，確認(rèn)Ⅱ°燒傷模型建模成功。燒傷組大鼠不做其他處理，燒傷LA組、燒傷LA+ODN組、燒傷LA+A317491組和燒傷LA+ATP組大鼠在燒傷前24 h開始，給予LA(6 mg/kg)腹腔注射，1次/24 h，共5次；燒傷LA+ODN組每日另PAG微量注射0.3 μL(0.3 nmol)P2X3反義寡聚核苷酸 (A-ODN)，共5次；燒傷A317491組和燒傷LA+ATP組：取燒傷后48 h大鼠，PAG微量注射0.3 μL(1.5 nmol) A-317491或0.3 μL(3 nmol) αβ-meATP。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國際疼痛學(xué)會應(yīng)用動物進(jìn)行疼痛研究的倫理綱要操作。

1.2.2 機(jī)械痛閾(mechanical withdrawal threshold，MWT)的檢測：采用電子Von Frey測痛儀(2390系列，IITC Life Science公司)。將大鼠置于底帶孔的有機(jī)玻璃籠中，測試前大鼠適應(yīng)環(huán)境30 min，測痛儀刺激大鼠后肢足底中部2s，出現(xiàn)縮足反應(yīng)時(shí)讀數(shù)為MWT，重復(fù)3次取平均值。檢測時(shí)間點(diǎn)為燒傷前(0 h)以及燒傷后(12、24、36、48、60和72 h)。

1.2.3 Western blot檢測P2X3受體蛋白表達(dá)：取燒傷后48 h大鼠，每組隨機(jī)取6只。大鼠4%水合氯醛(20 mL/kg i.p.)麻醉后，取腦組織稱重，研脆后加入裂解液；裂解后上清液冷凍干燥形成蛋白沉淀，BCA法蛋白定量；待測樣品(蛋白含量20 μg)加樣，電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入一抗：抗大鼠P2X3抗體(1∶600)和抗大鼠β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜后加入二抗。化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑與PVDF膜共孵育后顯影，定影。圖像進(jìn)行目標(biāo)條帶掃描(方正掃描儀F5600)，BIO-RAD的生物圖像處理系統(tǒng) (PDQUEST)進(jìn)行灰度測定，以β-actin為內(nèi)參對照，對所測目標(biāo)蛋白的條帶灰度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到各組P2X3蛋白相對吸光度值 (relative absorbance,A)。

1.2.4 PAG微量注射：大鼠給予4%水合氯醛麻醉(10 mL/kg i.p.)，麻醉成功后，將大鼠置于腦立體定位儀(SR-5R型，成茂公司)。參照文獻(xiàn)行PAG插管及藥物注射[4]。

1.2.5 寡聚核苷酸序列的設(shè)計(jì)和配制：反義寡聚核苷酸的序列是以P2X3 cDNA堿基序列401～419為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)，序列為：5′-TAATCCGACACGTCCATGA-3′溶于無核苷酸超純水，終濃度為10 nmol/μL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 燒傷對大鼠MWT影響

燒傷前，6組大鼠MWT值無差異。燒傷后MWT值持續(xù)下降；燒傷組在燒傷后48 h MWT值達(dá)到最低值，顯著低于燒傷前或同時(shí)間點(diǎn)正常組MWT值 (Plt;0.001)，其后有小幅緩慢上升 (圖1)。

2.3 高烏甲素對燒傷大鼠MWT影響

燒傷大鼠給予LA治療后其MWT值均高于同時(shí)間點(diǎn)燒傷組。燒傷后48 h，燒傷LA組MWT值顯著高于燒傷組MWT值 (Plt;0.001) (圖1)。

*Plt;0.001 compared with normal group; #Plt;0.01 compared with burn group；##Plt;0.001 compared with burn group圖1 高烏甲素對燒傷大鼠機(jī)械痛閾的影響Fig 1 Effect of lappaconitine on mechanical withdrawal threshold of burn pain rats

2.4 PAG中P2X3蛋白表達(dá)的情況

燒傷組相對吸光度值高于正常組(Plt;0.01)；燒傷LA組大鼠相對吸光度值顯著高于燒傷組(Plt;0.001)；燒傷LA+ODN組相對吸光度值低于正常組(Plt;0.001) (圖2，3)。

2.5 A-ODN對LA鎮(zhèn)痛作用的影響

燒傷建模前，燒傷LA+ODN組大鼠MWT值與其他實(shí)驗(yàn)組無差異。燒傷后各觀察時(shí)間點(diǎn)其MWT值與燒傷組無差異 (圖1)。

圖2 大鼠PAG中P2X3受體蛋白水平Fig 2 Level of P2X3 receptor protein in rat PAG

*Plt;0.01 compared with normal group; **Plt;0.001 compared with normal group; #Plt;0.001 compared with burn group圖3 PAG中P2X3受體蛋白相對吸光度值Fig 3 Relative absorbance of P2X3 receptor protein in rat PAG

2.6PAG微量注射P2X3受體激動劑和拮抗劑對LA的鎮(zhèn)痛作用影響

PAG注射P2X3受體激動劑αβ-meATP后10 min，MWT值比注射前顯著提高 (Plt;0.001)；PAG注射P2X3受體特異性拮抗劑A317491后10 min，MWT值比注射前顯著下降 (Plt;0.001) (圖4)。

*Plt;0.001 compared with burn LA group on 48 hr post burn圖4 P2X3受體激動劑、拮抗劑對高烏甲素治療燒傷大鼠機(jī)械痛閾的影響Fig 4 Effects of P2X3 receptor agonist and antagonist on mechanical withdrawal threshold of LA-treated burn pain rats

3 討論

由于燒傷后損傷神經(jīng)可出現(xiàn)離子通道功能異常、神經(jīng)異常放電等，導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛，因此燒傷后早期有效的鎮(zhèn)痛是避免神經(jīng)性疼痛的關(guān)鍵[5]。對燒傷疼痛大鼠早期給予腹腔注射LA，可以顯著緩解燒傷疼痛大鼠的疼痛癥狀，升高其痛閾值，其鎮(zhèn)痛作用效果與LA劑量相關(guān)[3]。破壞PAG結(jié)構(gòu)后可顯著減弱LA的鎮(zhèn)痛作用，說明LA的鎮(zhèn)痛作用至少有PAG的介入[6]。

ATP受體中與疼痛關(guān)系最密切的是P2X3受體。總的看來，外周和脊髓的P2X3受體活化可促進(jìn)疼痛的形成和維持，例如：炎性疼痛和神經(jīng)性疼痛時(shí)，大鼠背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角神經(jīng)元和外周神經(jīng)末梢P2X3受體表達(dá)上調(diào)[2,7]；Ⅰ°和淺Ⅱ°燒傷也引起P2X3受體在燒傷創(chuàng)面神經(jīng)終末表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)疼痛產(chǎn)生和維持[8]。對脊髓上結(jié)構(gòu)P2X3受體在疼痛調(diào)制中作用的研究相對較少，腦室或藍(lán)斑P2X受體活化可提高大鼠痛閾；炎性疼痛大鼠側(cè)腦室注射α,β-meATP可激活腦干P2X3受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，說明脊髓上結(jié)構(gòu)P2X3受體活化可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)：正常組大鼠PAG僅少量P2X3受體蛋白表達(dá)，燒傷引起P2X3受體在PAG表達(dá)增加，給予多次腹腔注射LA后，燒傷大鼠PAG中P2X3受體蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)伴機(jī)械痛閾提高，疼痛相關(guān)的行為學(xué)變化緩解。

在神經(jīng)性疼痛調(diào)制中，P2X3受體功能比P2X3受體表達(dá)更為重要[10]。本研究中，PAG微量注射P2X3受體特異性阻斷劑A317491后，燒傷疼痛大鼠的機(jī)械痛閾顯著下降，減弱LA鎮(zhèn)痛作用；相反，給予P2X3受體激動劑α,β-meATP引起燒傷疼痛大鼠機(jī)械痛閾顯著提高，加強(qiáng)LA鎮(zhèn)痛作用。

反義寡聚核苷酸技術(shù)(antisense oligonucleotide，ASO)能使研究的目標(biāo)基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而明確該基因或蛋白的功能。本實(shí)驗(yàn)在燒傷大鼠PAG微量注射P2X3受體A-ODN下調(diào)P2X3受體蛋白表達(dá)后, LA的鎮(zhèn)痛作用明顯減弱，其機(jī)械痛閾值變化趨勢與單純燒傷大鼠無差異。

本研究證實(shí)：大鼠燒傷疼痛激活內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)引起PAG中P2X3受體表達(dá)上調(diào)及功能的增強(qiáng)，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)。由于LA可促進(jìn)PAG中P2X3受體的表達(dá)和功能，因此可加強(qiáng)機(jī)體的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用。

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Analgesic mechanism of lappaconitine in rat midbrain periaqueductal gray

XIAO Zhi1*, ZHANG Fu-an2, ZHANG Lan-yin2

(1.Research Center for Medicine amp; Biology; 2.the First Clincial Institute Grade 2009, Zunyi Medical College, Zunyi 563000, China)

ObjectiveTo investigate the analgesic effect of lappaconitine (LA) and its supraspinal analgesic mechanism with rat model.MethodsMale Sprague-Dawley rats were divided into 6 groups: normal, burn, burn LA，burn LA plus antisense oligodeoxynucleotide (A-ODN)，burn LA plus A317491 and burn LA plus ATP. The later 4 groups had LA (6mg/kg) administered intraperitoneally. The pain threshold was characterized by the mechanical withdrawal threshold (MWT) testing; The expression of P2X3 receptor protein in the midbrain periaqueductal gray (PAG) was assessed by Western blot analysis. Observation the intra-PAG injection of P2X3 A-ODN, selective antagonist and agonist of P2X3 receptor on the analgesic effect of LA were performed.ResultsIn burn group, the MWT was decreased while increased in burn LA group. LA induced a significantly up-regulated P2X3 receptor protein expression in PAG. The antinociceptive effect of LA was attenuated significantly by P2X3 A-ODN. The α,β-meATP or A317491 significantly enhanced or attenuated analgesic effect of LA, respectively.ConclusionsLA produces an antinociceptive effect on burn pain via increases expression and function of P2X3 receptors in the PAG.

lappaconitine; burn pain; P2X3 receptor; midbrain periaqueductal gray

2013-06-25

2013-09-24

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項(xiàng)資金[黔省專合字(2011)59]；遵義醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃[院發(fā)(2012)2906]

*通信作者(correspondingauthor)： 1643255058@qq.com

1001-6325(2014)03-0324-04

研究論文

R 441.1

A