N-cadherin對大鼠脊髓損傷后移植神經干細胞存活、增殖與遷移的影響

顏建輝，黃麗娟，楊 柳，華力明

(湘南學院 1.臨床醫學系 內科教研室; 2.附屬醫院 神經內科,湖南 彬州 423000 )

N-cadherin對大鼠脊髓損傷后移植神經干細胞存活、增殖與遷移的影響

顏建輝1,2*，黃麗娟2，楊 柳2，華力明2

(湘南學院 1.臨床醫學系 內科教研室; 2.附屬醫院 神經內科,湖南 彬州 423000 )

目的探討神經鈣黏蛋白(N-cadherin)對大鼠脊髓損傷(SCI)后移植神經干細胞(NSCs)存活、增殖與遷移的影響。方法60只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、移植 1組和移植 2組。橫斷T12復制SCI模型。移植 1組行原代培養NSCs移植；以lentivirus病毒為載體將N-cadherin轉染至原代培養NSCs再植入移植 2組。BBB評分評定大鼠神經功能。術后5、10和15 d免疫熒光檢測NSCs存活、增殖和遷移。結果模型組BBB評分顯著低于對照組(Plt;0.05)；各移植NSCs組BBB評分均高于模型組(Plt;0.05)，但以移植2組評分最高(Plt;0.05)；移植2組各時間點巢蛋白(Nestin)陽性細胞數量均顯著多于移植1組(Plt;0.05)，以15 d 的數量最多(Plt;0.05)；移植2組各時間點Nestin陽性細胞遷移距離顯著長于移植1組。結論N-cadherin可以促進NSCs的存活、增殖與遷移，以修復SCI大鼠的神經功能。

神經鈣黏蛋白；脊髓損傷；神經干細胞

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是由于外力或其他因素的原發性損傷使得灰質區發生出血性壞死灶，同時造成神經細胞膜和結締組織的剪切性損傷，致殘率高[1]。神經干細胞(neural stem cells, NSCs)的主要功能是修復中樞神經系統損傷的組織，研究證實，NSCs移植可以顯著促進內源性神經干細胞的增殖、遷移和神經發生[2]，因而在SCI的治療中顯示了良好的應用前景。研究表明，神經鈣黏附蛋白(N-cadherin)在神經軸突的導向生長、靶向識別、以及突觸形成中起著重要作用[3]，但是關于N-cadherin對NSCs的存活、增殖與遷移的尚影響鮮有報道，本實驗基于此進行研究，以其揭示N-cadherin在NSCs治療SCI中的作用機制，為SCI的臨床研究開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物造模及分組

清潔級雌性SD大鼠60只，體質量200～220 g，孕10～14 d的SD大鼠1只(湘南學院實驗動物中心。合格證號：0114866)。60只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、移植1組和移植2組，15只/組，除對照組大鼠外，腹腔內注入3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠，參照文獻[4]將T12[5]脊髓橫行切斷，制備脊髓損傷模型，以大鼠麻醉醒后出現雙下肢呈現癱瘓等為造模成功。

1.2 主要試劑

巢蛋白(Nestin)抗體、多聚賴氨酸(Chemicon公司)；B27復合物、堿性成纖維細胞生長因子和表皮細胞生長因子(Sigma公司)；胎牛血清、DMEM/F12(1∶1)培養基(Hyclone公司)；DAB顯色劑和免疫組化試劑盒(武漢子心生物科技公司)；Trizol試劑盒、RNA 抽提試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；N-cadherin單克隆抗體(Abcam公司)；lentivirus病毒(Glibco公司)。

1.3 方法

1.3.1 分離、培養NSCs：將孕SD大鼠處死參照文獻[6]的方法分離、培養NSCs，并傳代培養，制備NSCs懸液，調整濃度至1×105/mL，加入10 μmol/L的BrdU進行標記[7]，分成兩份備用。

1.3.2 N-cadherin克隆及過表達：利用Pubmed查找N-cadherin基因序列如下：上游引物:5′-ACTG AGGAGCCGATGAAGGAACCAC-3′，下游引物:5′-GTTGATGATGAAGATGCCCGTTGGA-3′。利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設計引物。克隆大鼠N-cadherin全長編碼序列，表達于lentivirus病毒載體，經293T細胞包裝后，收集病毒，轉染至原代培養NSCs，操作參照Lipofectamine 2000試劑說明書。

1.3.3 N-cadherin的表達：分別以Western blot檢測原代培養NSCs和病毒感染NSCs中的N-cadherin表達。加入200 μL蛋白裂解液，提取總蛋白，凝膠電泳，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，β-actin 抗體為內參。

1.3.4 NSCs移植：將原代培養NSCs懸液和感染lentivirus病毒的NSCs懸液各10 μL分別緩慢注入到移植1組和移植2組大鼠損傷脊髓內，逐層縫合肌肉和皮膚，碘伏消毒后紗布包扎切口。

1.4 神經功能評分

觀察各組大鼠造模后及移植后5、10和15 d的運動情況，以SCI運動功能BBB評分從0～21分對大鼠神經功能進行評價。

1.5 免疫熒光觀察Nestin標記細胞

分別于移植后5、10和15 d腹腔麻醉大鼠，多聚甲醛灌注固定，取損傷部位脊髓2 cm，石蠟包埋固定，切片，常規脫蠟，胰蛋白酶消化，羊血清封閉，滴加一抗小鼠抗Nestin抗體(1∶100)，4 ℃過夜，PBS代替一抗作為陰性對照；滴加FITC結合的熒光二抗(1∶100)，以甘油碳酸鹽緩沖液封固，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.6 計數損傷脊髓區內存活、增殖的NSCs

以移植處為中心，分別向頭端和尾端進行連續橫切片，每隔5片取1片，頭、尾端各取5片，×400倍視野下計數Nestin陽性細胞數。

1.7 測量NSCs遷移距離

對各組大鼠脊髓進行連續縱切片，每隔5片取1片，免疫熒光染色后，應用激光掃描共聚焦顯微鏡載物臺上標本移動距離測量尺測量 Nestin陽性細胞從頭端最遠處到尾端最遠處之間的距離。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 N-cadherin轉染至NSCs后的表達

N-cadherin在轉染lentivirus病毒的NSCs中表達顯著高于原代培養NSCs(圖1)。

2.2 各組大鼠各時間點的神經功能評分

模型組大鼠脊髓損傷評分標準(Basso, Beattie amp; Bresnahan locomotor rating scale, BBB scale)顯著低于對照組；兩移植組的BBB評分均顯著高于模型組(Plt;0.05)，但仍低于對照組(Plt;0.05)，移植時間越長評分越高；在相同時間點，移植2組BBB評分更高(Plt;0.05)(圖2)。

2.3 損傷脊髓內存活、增殖的NSCs

移植1組和移植2組移植區域均可見綠色熒光Nestin陽性細胞，細胞核為大小均一的圓形或橢圓形(圖3)。隨著移植時間延長，兩組的Nestin陽性細胞均逐漸增加，以15 d的數量最多(Plt;0.05)，但是在同一時間點，移植2組數量更多(Plt;0.05) (表1)。

A.the primary culture of NSCs; B.infected cells by virus圖1 轉染的NSCs中N-cadherin的表達Fig 1 Expression of N-cadherin gene in transfected NSCs

With transplantation time prolonged, BBB score increased significantly in transplanting group 1 and transplanting group 2 (Plt;0.05)；At the same time point, BBB score of transplanting group 2 was significantly higher (Plt;0.05)圖2 大鼠各時間點BBB評分Fig 2 BBB score of rats in each group at each time

2.4 各移植組損傷脊髓內移植 NSCs 的遷移距離

各移植組均有Nestin陽性細胞從損傷脊髓處移植遷移到脊髓其他部位，各組15 d的遷移距離均要長于10、5 d組(Plt;0.05)。在同一時間點比較，移植2組Nestin陽性細胞的遷移距離更長(Plt;0.05) (表2)。

A,B,C.were Nestin positive cells in transplanting group 1 at 5, 10, 15 days；D,E,F.were Nestin positive cells in transplanting group 2 at 5, 10, 15 days圖3 移植1組和移植2組內Nestin陽性細胞Fig 3 The survival and proliferated Nestin positive cells in transplanting group 1 and transplanting group 2(Immunofluorescence staining)

表1 比較兩組損傷脊髓內存活、增殖的Nestin陽性細胞數量Table 1 Comparison of the number of Nestin positive cells in the survival, proliferation spinal cordinjury between transplanting group 1 and 2

*Plt;0.05 compared with transplanting group 1.

表2 比較兩組損傷脊髓內移植NSCs的遷移距離Table 2 Comparison of the migration distance of spinal cord injuries transplantation NSCs in transplant- ing group 1 and 2(±s,mm, n=15)

*Plt;0.05 compared with transplanting group 1.

3 討論

由于NSCs終身保持產生祖細胞的能力，在細胞遷移的間斷性運動過程中可產生大量神經元，促進神經功能恢復，可作為一種替代手段用于中樞神經損傷、退行性疾病和腦腫瘤等疾病的治療[8-9]。

神經鈣黏附蛋白(N-cadherin)對于腫瘤上皮細胞及表達N-cadherin的血管平滑肌細胞和內皮細胞之間的黏附起著重要作用。N-cadherin 還是一種凋亡抑制因子，可以促進腫瘤細胞的生長和存活[10]。但是其是否參與干細胞的遷移及歸巢中，目前尚缺乏完善的研究。

本實驗Western blot顯示N-cadherin成功轉入NSCs中，且呈過表達狀態。將原代培養NSCs和含有過表達N-cadherin的NSCs分別植入移植1組和2組大鼠，兩組大鼠的下肢運動功能均得到了一定程度的恢復，由此證明，NSCs移植可以修復大鼠損傷脊髓的神經功能。同時實驗結果說明移植時間越長，大鼠的運動功能恢復的越好，而且移植2組的大鼠神經功能恢復優于移植1組。

檢測SCI大鼠移植NSCs后的存活和增殖情況，發現移植區域附近均可見到大小均一的圓形或橢圓形Nestin陽性細胞，而且均以15 d時Nestin陽性細胞數量最多，說明移植時間越長NSCs的存活和增殖情況越好；但是相比于同一時間點，移植2組Nestin陽性細胞數量更多。研究人員發現各移植組均有Nestin陽性細胞從損傷脊髓處向脊髓其他部位遷移，各組15 d時的遷移距離均明顯長于10、5 d組，在同一時間點，移植2組遷移距離則更長，提示移植2組可以促進大鼠NSCs的遷移，且隨著時間的增加其遷移范圍越廣。

綜上所述，N-cadherin可以促進NSCs的存活、增殖與遷移，從而修復損傷脊髓大鼠的神經功能，但是其具體作用機制是通過什么樣的傳導途徑發揮的尚需要進一步深入研究，也是研究的新方向。

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Effect of N-cadherin on survival，proliferation and migration of neural stem cells transplanted into injured spinal cord of rats

YAN Jiang-hui1,2*, HUANG Li-juan2, YANG Liu2, HUA Li-ming2

(1.Dept. of Internal Medicine, Xiangnan University；2.Dept. of Internal Medicine, Affiliated Hospital of Xiangnan University, Binzhou 423000, China)

ObjectiveTo investigate the effect on survival，proliferation and migration of NSCs transplanted into SCI of rats.MethodsSixty SD rats were divided into control group, SCI group, transplanting group 1 and transplanting group 2. Using lentivirus virus as a vector, N-cadherin was transfected into primary cultured NSCs to implant in transplanting group 2. Neurological function were evaluated by BBB score. Immumofluorescence was used to detecte the survival，proliferation and migration of NSCs at 5, 10 and 15 d.ResultsBBB score of SCI group was lower than that of control group. BBB score in two transplanted groups increased significantly(Plt;0.05), with most evident in transplanting group 2(Plt;0.05). The number of Nestin-positive cells in transplanting group 2 was more than that in transplanting group 1 at the corresponding time point(Plt;0.05). The number of Nestin-positive cells at 15 d was the most among three time points(Plt;0.05). The immigrating distance in transplanting group 2 was longer(Plt;0.05)．ConclusionsN-cadherin can promote the survival, proliferation and migration of NSCs in SCI rats to repair neurological function.

N-cadherin; spinal cord injury; neural stem cells

2013-02-18

2013-06-26

*通信作者(correspondingauthor)： chenhaojingzhou@163.com

1001-6325(2014)03-0372-04

研究論文

R 74

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