抗凝血酶基因10381T缺失導致的Ⅰ型抗凝血酶缺陷癥

李正民，宮璀璀，呂金利，方盼盼，王廣蘭，倫永志，白 潔

(1.鄭州大學 第三附屬醫院 科研中心, 河南 鄭州 450000；2.中國人民解放軍第153中心醫院 檢驗科， 河南 鄭州 450042;3.濟南軍區普外科中心， 河南 鄭州 450000； 4.新鄉醫學院 研究生院，河南 新鄉 453000；5.大連大學 醫學院醫學研究中心，遼寧 大連 116000；6.中國人民解放軍總醫院 北京301醫院 全軍檢驗中心， 北京 100000)

抗凝血酶基因10381T缺失導致的Ⅰ型抗凝血酶缺陷癥

李正民1，2，宮璀璀1,2*，呂金利3，方盼盼1，王廣蘭2，4，倫永志5，白 潔6

(1.鄭州大學 第三附屬醫院 科研中心, 河南 鄭州 450000；2.中國人民解放軍第153中心醫院 檢驗科， 河南 鄭州 450042;3.濟南軍區普外科中心， 河南 鄭州 450000； 4.新鄉醫學院 研究生院，河南 新鄉 453000；5.大連大學 醫學院醫學研究中心，遼寧 大連 116000；6.中國人民解放軍總醫院 北京301醫院 全軍檢驗中心， 北京 100000)

目的對1例遺傳性抗凝血酶(AT)缺陷癥先癥者及其家系進行表型診斷和基因診斷，并探討其家系成員發病機制。方法用發色底物法檢測該家系9名成員的AT活性(AT∶A)、蛋白S活性(PS∶A)、蛋白C活性(PC∶A)，用免疫比濁法檢測AT抗原量(AT∶Ag)，用Western blot檢測血漿中的AT分子質量和含量，抽提外周血基因組DNA，用PCR對AT基因的7個外顯子及其側翼序列進行擴增，用直接測序法對該家系所有成員的擴增產物進行測序分析并進行基因突變檢測，同時篩查100例正常人以排除基因突變的多態性。結果該家系先癥者AT∶A 和AT∶Ag分別為48%和121 mg/L，先癥者AT基因的第6外顯子發現10381T del。其家系的部分成員檢測到相同的移碼突變。結論該家系先癥者及部分成員存在Ⅰ型遺傳性抗凝血酶缺陷癥，是由AT基因10381T del移碼突變所致。

抗凝血酶；基因突變；易栓癥

人體的抗凝系統主要有抗凝血酶(antithrombin, AT)系統(包括抗凝血酶和肝素等)和蛋白C系統(包括蛋白C, 蛋白S等)，抗凝系統的功能異?？蓪е卵ㄐ纬蓛A向增高，引起易栓癥。常見的遺傳性易栓癥有蛋白S缺陷癥、蛋白C缺陷癥、抗凝血酶缺陷癥、抗活化的蛋白C癥(FV Leiden突變)、凝血酶原20210A突變等。抗凝血酶(AT)是一種絲氨酸蛋白酶(serpins)抑制劑，主要具有抑制絲氨酸蛋白酶活性的凝血酶以及Ⅶa、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa、Ⅻa等因子，是人體最重要的抗凝因子之一，約占抗凝活性的70%左右，在人體抗凝系統中發揮著重要作用。遺傳性抗凝血酶缺陷癥是遺傳性易栓癥的一種，是由于編碼抗凝血酶的基因發生突變所引起的一種常染色體顯性遺傳病，在人群中的發病率為萬分之二到萬分之五[1-2]。現對一例抗凝血酶缺陷癥家系進行了家系調查、臨床表型診斷、實驗診斷和基因診斷，發現了一個10381T del移碼突變。

1 資料與方法

1.1 家系資料

先癥者，男，漢族，51歲，1981年首次出現下肢靜脈血栓，后反復多次出現下肢靜脈血栓，2011年5月因腹痛入院，經剖腹探查發現腸系膜靜脈血栓,行外科手術治療，2012年3月因右下肢腫脹疼痛再次入院治療，經血管造影診斷為右下肢深靜脈血栓形成，后口服華法林治療半年，病情好轉。現定期監測凝血機制，以預防性治療為主。家族史陽性，家系3代10人中，其母親、兩個姐姐、侄子均有下肢靜脈血栓史，家系其他成員無類似病史。家系圖見圖1。

圖1 遺傳性AT缺陷癥家系圖Fig 1 Hereditary AT deficiency pedigree chart

1.2 標本采集與相關指標檢測

在獲得該家系所有成員的知情同意后，對家系成員9人分別采用負壓靜脈采血，枸櫞酸鈉抗凝管采血2.7 mL(1∶9抗凝)2管、干燥管采血5 mL、乙二胺四乙酸(EDTA)管采血2 mL。立即4 ℃ 3 000 r/min離心10 min(除EDTA管)，收集1管部分枸櫞酸鈉抗凝血漿凍存-80 ℃，其他樣本分別進行血液細胞分析、凝血4項(PT、APTT、TT和FIB；)、D-D二聚體檢測(Stago公司)、肝功能、腎功能、同型半胱氨酸(HCY)含量檢測(四川邁克生物科技股份有限公司)、狼瘡抗凝物(LA)、抗心磷脂抗體檢測(北京貝爾公司)、蛋白C活性(PC:A)、蛋白S活性(PS:A)、AT活性檢測(采用發色底物法，Dade Behring公司)、AT抗原量檢測(采用免疫比濁法， Beckman Coulter公司)等。

1.3 血漿中AT分子質量和含量檢測

采用Western blot檢測:將該家系成員血漿20倍稀釋(用磷酸鹽緩沖液-PBS)，與上樣緩沖液3∶1混合，放入100 ℃沸水中加熱5 min。用10% SDS-PAGE電泳(60 V,55 mA,3.5 h)后，經濕轉法(60 V,160 mA,3 h)將蛋白條帶轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉(脫脂奶粉0.5 g，TBST 10 mL)封閉1 h, 用一抗(antithrombin Ⅲ rabbit monoclonal antibody， EPIT MICS，An Abcam公司)孵育2 h，徹底清洗后用二抗(HRP標記的goat anti-rabbit IgG，上海生工公司分裝)孵育。徹底清洗后用DAB顯色液(北京中杉金橋公司)顯色10 min。蛋白質分子量標記采用彩色預染蛋白質Marker(10～180 kd)。

1.4 基因組DNA抽提

用該家系成員外周血(枸櫞酸鈉抗凝)，采用DNA提取試劑盒(Fermentas公司)提取全基因組DNA，嚴格按照試劑說明書操作提取。

1.5 PCR擴增及產物純化

使用Primer5引物設計軟件設計AT基因第3外顯子及其側翼序列的擴增引物，第1、2、4、5、6和7外顯子的擴增引物序列參照文獻報道[3]，引物信息見表1。PCR總體系為25 μL：1×緩沖液，dNTP終濃度為0.25 mmol/L，MgCl2終濃度為1.5 mmol/L，引物終濃度為0.2 μmol/L，模板DNA 50 ng，Taq酶為1.25 U(TIANGEN公司)。反應條件為：95 ℃預變性5 min，然后95 ℃ 30 s，57 ℃退火30 s(第3外顯子采用62 ℃退火，第5外顯子采用60 ℃退火)，72 ℃延伸30s,30個循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物80 μL，加20 μL電泳緩沖液(4∶1),混勻后進行瓊脂糖電泳(18 g/L瓊脂糖，含溴化乙錠)，在254 nm紫外燈下切取相應條帶，用QIAquick Extracion Kit試劑盒進行PCR產物回收、純化(QIAGEN公司)。

1.6 AT基因測序及突變分析

PCR純化產物由上海生工生物工程有限公司進行正向和反向測序，測序儀器為ABI公司3730xl基因分析儀，試劑為BigDye terminator v3.1，測序圖譜分析采用Chromas軟件。用BLAST在線工具將該家系成員AT基因測序結果與AT基因序列(Genbank:X68793.1)進行比對，分析基因突變。將AT基因第6外顯子(存在10381Tdel)經再次PCR擴增、純化、雙向測序,再次進行基因突變驗證分析。

1.7排除基因多態性及FVLeiden突變和凝血酶原G20210A突變

針對該家系突變位點，對100名正常人進行篩查：抽取枸櫞酸鈉抗凝血2 mL，提取DNA，PCR擴增相應突變位點，測序后進行相應位點突變分析，以排除基因多態性。對先癥者FV Leiden突變檢測：引物為F, 5′-CCATTATTTAGCCAGGAGACC 3′，R, 5′-ATTGGTTCCAGCGAAAGC 3′；對外顯子10及側翼序列進行擴增(退火溫度60 ℃)、測序。對先癥者凝血酶原G20210A突變檢測：引物為F,5′-TCTAG AAACAGTTGCCTGGC 3′, R, 5′-TCCAGTAGTATT ACTGGCTC 3′；對外顯子14及側翼序列進行擴增(退火溫度53 ℃)、測序。

2 結果

2.1 易栓癥初篩檢測結果

先癥者檢測結果 AT:A 48.4%,AT:Ag 121 mg/L,PS:A 164%,PC:A 100.4%,PT 14.6s,INR 1.21,APTT 35.8 s,TT 14.0 s,FIB 3.38 g/L。該家系9人中有5人(先癥者及其母親、兩個姐姐、侄子)表現為AT∶Ag和AT∶A的降低，而蛋白C和蛋白S活性正常。該家系成員的血液細胞分析、凝血4項(PT、APTT、TT和FIB)、肝功能和腎功能無明顯異常，D-D二聚體、抗心磷脂抗體、LA和同型半胱氨酸檢測結果均正常。

2.2 血漿AT蛋白Western blot檢測結果

該家系成員的AT蛋白在58 ku區域處存在與正常對照分子量一致的特異性條帶，但該家系中有5人(含先癥者)的AT蛋白條帶陽性強度明顯減弱(分別為Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅰ2和Ⅲ1)(圖2)。

表1 AT基因PCR引物序列及擴增區域Table 1 AT gene PCR primers and amplified region

圖2 該家系AT蛋白Western blot檢測結果Fig 2 The pedigree AT protein Western blot test results

2.3 基因檢測分析

先癥者的AT基因第6外顯子存在一處缺失，即：10381 Tdel,引起了移碼突變，導致該位點之后的編碼序列發生改變，造成翻譯的第400位到403位4個氨基酸被不同氨基酸替代，分別為Phe400Ser,His401Ile,Lys402Arg,Ala403his，第405位亮氨酸之后提前終止編碼，第406位到最后464位氨基酸出現缺失；該家系中還有4名成員的AT基因第6外顯子存在10381 Tdel，與先癥者的AT基因存在相同突變，測序圖見(圖3)。

圖3 先癥者第6外顯子部分測序結果Fig 3 The proband’s exon sixth part of sequencing results(positive sequence, arrow indicates the deletion site)

2.4AT基因突變位點多態性排除及FVLeiden突變和凝血酶原G20210A突變檢測

對于該家系發現的AT基因突變位點，通過對100名正常人的相應位點測序分析，未發現相同突變，可以排除該突變位點的基因多態性。對先癥者的FV基因第10外顯子和凝血酶原基因第14外顯子進行PCR擴增、產物測序，未發現FV Leiden突變和凝血酶原G20210A突變。

經基因數據庫(http://www1.imperial.ac.uk/departmentofmedicine/divisions/experimentalmedicine/haematology/coag/antithrombin/type1/.)檢索后發現，該AT基因10381 Tdel雜合突變在國內外未發現有相同位點突變的報道。國內報道的AT基因缺失突變較少，已報道了3例，本例為第4例。

3 討論

AT能夠滅活凝血酶、FXa等因子，具有抗凝血作用，與肝素結合后可使抗凝血作用增加數千倍以上[4]。有研究報道[5]: AT有兩個重要的功能區，一個是位于羧基(C)端的反應位點,能夠滅活凝血酶; 另一個是位于氨基(N)端的肝素結合區。有研究顯示，AT在血液中的濃度較低，此時的抗凝活性也低，當有肝素分子存在的情況下，能夠與肝素中的戊糖(pentasaccharide)序列結合，AT的構象發生改變，反應中心環(RCL)暴露，能夠最有效的發揮抗凝作用[6-7]。

AT基因的突變可以導致AT蛋白的分泌障礙、胞內滯留而不能發揮抗凝作用，還可以使AT的反應位點異常變異而致活性降低，或者使AT的肝素結合位點異常變異而致與肝素親和力降低。AT缺陷癥臨床表現為反復形成靜脈血栓，如腸系膜靜脈、髂靜脈和下肢深靜脈等。遺傳性AT缺陷癥在臨床上可分為兩型：Ⅰ型，是由于AT合成障礙，表現為AT含量的減少和AT活性的降低；Ⅱ型，是由于AT結構的異常，僅表現為AT活性的降低。缺失突變是一種由于基因組DNA多核苷酸鏈中堿基對的缺失，以致自缺失點之后部分或所有的三聯體遺傳密碼子組合發生改變的基因突變形式。據報道：法國的兩個家族中AT的外顯子3A上分別出現小移碼缺失，因此引起患者的AT基因缺乏翻譯，AT分泌減少，導致兩家族多成員發生血栓栓塞癥[8]。關于多部位的缺失，有報道發現了AT基因組12個部位的缺失，這些缺失突變造成終止密碼子的形成，轉錄提前停止，從而影響AT肝素結合位點和反應位點的形成，降低了AT活性[9]。

該家系先癥者反復多次出現下肢靜脈血栓，近年來出現腸系膜靜脈血栓，經基因分析的診斷結果顯示存在AT基因10381T缺失，且排除獲得性易栓癥、FV Leiden突變和凝血酶原G20210A突變。該缺失突變導致AT讀碼框架移位，第399位丙氨酸之后編碼表達了4個不同的氨基酸(S、I、R和H替代了F、H、K和A)，導致氨基酸序列的改變，且第405位亮氨酸之后提前出現終止密碼子，蛋白質表達提前終止，僅編碼了405個氨基酸(正常AT蛋白由464個氨基酸組成)，用Spdbv軟件分析發現，空間位阻增加，AT構象發生改變，影響了反應中心環的暴露。先癥者的母親及兩個姐姐、侄子都存在相同位點的缺失突變，均有不同程度的靜脈血栓形成史，根據以上相應檢查結果可明確診斷該家系存在遺傳性AT缺陷癥Ⅰ型。

綜上所述，AT基因10381 Tdel雜合突變在國內外未發現相同位點缺失的報道，該研究對該家系易栓癥的明確診斷、治療提供了基因診斷依據和理論支持，為以后的疾病預防干預、減少血栓性疾病所帶來的身心痛苦和財產損失提供幫助，為遺傳性易栓癥的分子診斷、發病機制研究提供資料。

[1] Fischer R, Sachs UJ, Heidinger KS,etal. Prevalence of hereditary antithrombin mutations is higher than estimated in patients with thrombotic events[J].Blood Coagul Fibrinolysis, 2013,24:444-448.

[2] Cooper PC, Coath F, Daly ME,etal. The phenotypic and genetic assessment of antithrombin deficiency[J].Clin chem lab med, 2010,48: 67-78.

[3] 傅啟華，許先國，丁秋蘭，等. 抗凝血酶基因13389G缺失導致的Ⅰ型抗凝血酶缺乏癥[J].中華血液學雜志，2002，23：588-590.

[4] Izaguirre G,Swanson R,Raja SM,etal.Mechanism by which exosites promote the inhibition of blood coagulation proteases by heparin activated antithrombin[J]. J Biol Chem, 2007,282:33609-33622.

[5] Patna Ikmm, Moll S. Inherited antithrombin deficiency: a reiew [J].Haemophilia,2008,14:1229-1239.

[6] Johnson DJ, Liw, Adams Te,etal. Antithrombin S195A factor Xaheparin structure reveals the allosteric mechanism of antitrombin activation[J].EMBO J, 2006,25:2029-2037.

[7] Muszbek L, Bereczky Z, Kovacs B,etal. Antithrombin deficienfy and its laboratory diagnosis[J].Pubmed-indexed for MEDLINE,2013,PMID:2106-2218.

[8] Veronique Picard, Alessundra Bura, Josep Emmericn,etal. Molecular bases of antithrombin deficiency in French families:identification of seven novel mutations in the antithrombin gene[J]. Bri J Haematol, 2000,110:731-734.

[9] J.Corral, J.A.Huntington, R.Gonzalez-conejero,etal. Mutations in the shutter region of antithrombin result in formation of disulfide-linked dimers and severe venous thrombosis[J].J Thrombo Haemost,2004,2:931-939.

Type Ⅰ antithrombin deficiency due to 10381T deletion in antithrombin gene

LI Zheng-min1,2, GONG Cui-cui1,2*, Lü Jin-li3, FANG Pan-pan1, WANG Guang-lan2,4,LUN Yong-zhi5, BAI Jie6

(1.Research Center, the third Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000; PLA No.153 Hospital;2.Ji’nan Military Region Inspection Center; 3.General Surgery Center, Ji’nan Military Region, Zhengzhou 450000;4.Graduate School,Xinxiang Medical College, Xinxiang 453000; 5.Medical Research Center, Dalian University School of Medicine,Dalian 116000;6.PLA Inspection Center，Beijing 301 Hospital-PLA General Hospital, Beijing 100000,China)

ObjectiveTo make a phenotype diagnosis and gene diagnosis aiming directly at one case of hereditary antithrombin (AT) deficiency syndrome of proband and their family phenotype, and explore the pathogenesis of family members.MethodsThe activity of AT(AT∶A), protein S and protein C were detected by chromogenic substrate method, with immune turbidimetry on AT antigen (AT∶Ag) detection, the molecules weight and content of AT were detected by Western bloting method, Genomic DNA was extracted from blood, the 7 exons of AT and flanking sequences were amplified by PCR, products of PCR of all family members were conducted by direct sequencing analysising and gene mutation detection, screening 100 cases of normal people to exclude the of polymorphism of gene mutation.ResultsThe AT∶A and AT∶Ag of proband was 48% and 121 mg/L respectively, the proband’sixth exon of AT gene is c.10381T del. Some members of the family were detected the same frameshift mutations.

ConclusionsThe pedigree and some members of the first symptoms are type Ⅰ hereditary antithrombin deficiency due to AT gene 10381T del frameshift mutations.

antithrombin; gene mutation; thrombophilia

2013-09-02

2013-11-27

*通信作者(correspondingauthor)： gongcuijin@yahoo.com.cn

1001-6325(2014)03-0397-05

研究論文

R 394.3

A