程序性壞死機制與缺血再灌注損傷

葉周恒，劉文武，孫學軍

(第二軍醫大學 潛水醫學教研室， 上海 200433)

程序性壞死機制與缺血再灌注損傷

葉周恒，劉文武，孫學軍*

(第二軍醫大學 潛水醫學教研室， 上海 200433)

程序性壞死是一種具有可調控的信號傳導通路的細胞壞死方式。多種刺激可導致程序性壞死的發生，復合體Ⅰ、復合體Ⅱ和RIP1-RIP3壞死體是通路中的信號分子，而Necstatin-1是程序性壞死的特異性阻斷劑。程序性壞死可能是缺血再灌注損傷中細胞死亡的重要方式。

程序性壞死；受體相互作用蛋白激酶1；受體相互作用蛋白激酶3

壞死是一種重要的細胞死亡方式，生理和病理條件下均可發生，主要表現為細胞器水腫、活性氧和胞內鈣升高、ATP含量下降以及細胞器和細胞膜最終破裂。過去認為壞死是不可調控的，因此，相對于凋亡而言，壞死的研究較少。然而，最近發現某些特殊的細胞中，給予特定的誘導劑，同時抑制凋亡通路后，可發生具有一定分子基礎的、可調控的細胞壞死，這種細胞死亡方式被稱之為程序性壞死。程序性壞死在病毒感染[1]、肝和腎的缺血再灌注損傷[2-3]等疾病中都可發揮重要作用。程序性壞死是一種新的細胞死亡方式，研究程序性壞死能幫助我們更好的理解許多生理病理過程并尋找疾病治療的新靶點。

1 程序性壞死的發現歷程

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)誘導細胞死亡的研究中，用顯微攝影技術觀察細胞形態，發現相同的TNF刺激能誘導不同細胞發生不同類型的細胞死亡[4]。TNF誘導F17細胞發生典型的凋亡，卻也誘導L-M細胞發生細胞壞死。NF-κB信號通路中的受體相互作用蛋白激酶(receptor interaction protein kinase, RIP)可能是這種新通路中的信號分子。死亡受體FAS也能引起這種壞死，且不依賴caspase活性，卻需RIP和FAS蛋白相關死亡區域(Fas-associated protein with death domain, FADD)的參與[5]。小分子抑制劑necrostatin-1，能特異性抑制這種特殊的細胞死亡方式[6]。這種具有可調控的信號通路的細胞死亡過程被命名為程序性壞死(Necroptosis)。Necrostatin-1的分子靶點是受體相互作用蛋白1(RIP1)[7]，necrostatin-1與RIP1的相互結合可使RIP1不激活[8]。此外，受體相互作用蛋白3(RIP3)在程序性壞死通路中的也具有重要作用[9]。混合線性激酶功能域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)，可能是RIP3下游分子蛋白[10]。此外，Akt[11]和ERK[12]通路也可能參與了程序性壞死。

2 程序性壞死的機制

2.1 程序性壞死的誘導

各種相應配體可以與腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)、CD95(也稱FAS)、腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor receptor 2, TNFR2)、TNF相關凋亡誘導配體受體1和2(TRAILR1和TRAILR2)結合誘導程序性壞死[4-5]。此外， 谷氨酸鹽[12]等也可通過未知分子機制引起程序性壞死。這些因素誘導的程序性壞死中，對TNFR1介導的程序性壞死進行的研究最為系統深入。因此雖然不排除不同受體介導的程序性壞死各自存在特殊的分子機制，下文以TNF誘導的程序性壞死為主，介紹程序性壞死的信號傳導通路(圖 1)。

圖1 程序性壞死分子機制Fig 1 Molecular mechanism ofnecroptosis

2.2 RIP1

RIP1在NF-κB通路中研究較多。已有研究表明，RIP1可以看做該通路中一個處于金字塔頂端的蛋白[5]。當RIP1被泛素化時，則選擇NF-κB通路介導細胞生存；當RIP1去泛素化，細胞被迫選擇死亡機制時，會出現凋亡或者程序性壞死[5]。因此RIP1泛素化是決定細胞壞死和存活的重要調節步驟。RIP1由3個功能區域組成：氨基末端激酶區域、中間區域和羧基末端死亡區域。程序性壞死過程中，RIP1的絲氨酸14/15，絲氨酸161等位點可發生自身磷酸化，這些位點都位于RIP1的氨基末端激酶區域[7]，提示RIP1氨基末端激酶區域在程序性壞死中起到了重要作用。活化的死亡受體募集RIP1，導致RIP1泛素化。這種泛素化狀態由凋亡胞內抑制劑(inhibitor of apoptosis protein, IAP)維持，當IAP的作用去除后，RIP1即可被去泛素化。藥物抑制cIAPs或基因敲除cIAPs，可抑制RIP1的泛素化，從而促進程序性壞死[13]。RIP1處于復合體Ⅰ中，復合體Ⅰ由活化的TNFR1聚集 RIP1、凋亡胞內抑制劑1(cIAP1)、cIAP2、TNFR相關因子2(TRAF2)，TRAF5，和TNFR結合死亡區域(TRADD)一起組成[8]。

2.3 RIP3

RIP3與RIP1具有共同的氨基末端激酶區域和羧基末端激酶RIP同型作用功能域(RIP homotypic interaction motif, RHIM)，不同的是RIP3不參與NF-κB通路。去泛素化的RIP1能募集RIP3，與TRADD、FADD和caspase-8一起組成復合體Ⅱ[14]，后者也被稱為死亡激發信號復合物(death-inducing signaling complex, DISC)。RIP1的去泛素化狀態是復合體Ⅰ轉變為復合體Ⅱ的重要因素[14]。去泛素化的RIP1能激活復合體Ⅱ中的caspase-8，后者則黏附并使RIP1和RIP3失活，同時黏附并活化BID和caspase-3，觸發caspase依賴的細胞凋亡。然而，當caspase激活被阻斷，復合體Ⅱ將啟動促壞死信號[5]。

2.4 RIP1-RIP3壞死體

Caspase被抑制后，RIP3通過RIP蛋白家族共同的氨基末端RHIM區域結合成超分子復合體，稱為RIP1-RIP3壞死體[15]。RIP1和RIP3相互結合后，去泛素化的RIP1發生自身磷酸化，RIP3又發生直接或者間接的第199位絲氨酸磷酸化[5]，引起程序性壞死[9-14]。Necrostatin-1可破壞RIP1與RIP3的結合，阻斷程序性壞死[14]。

MLKL由氨基末端卷曲(Coiled-Coil，CC)區域和羧基末端激酶樣區域組成，但缺少與其他蛋白結合的P環和磷酸化活性。MLKL缺失的細胞在程序性壞死過程中停留在壞死體環節，而RIP3可磷酸化MLKL，誘導致程序性壞死。因此，MLKL可能是壞死體的核心組成部分。Necrosulfonamide可以通過抑制MLKL活性阻斷程序性壞死[10]。

需指出的是，RIP1或者RIP3可能都不是程序性壞死的必需蛋白，因為敲除RIP1的鼠類胚胎成纖維細胞在TNF誘導下仍可發生程序性壞死[16]。

RIP1-RIP3壞死體下游引起細胞最終壞死的機制比較復雜，如：通過氧化應激途徑，增加胞內活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)導致程序性壞死[17]；通過多聚ADP核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase-1, PARP1][18]和線粒體釋放凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor, AIF)途徑導致DNA斷裂導致程序性壞死等[19]。

3 程序性壞死與缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷過程中細胞具有不同的死亡方式，包括壞死、凋亡和自噬等。程序性壞死的發現為細胞死亡方式添加了新的可能。程序性壞死通路抑制劑Nec-1不僅可以在體外阻止細胞發生程序性壞死，也有結果表明可以增強鼠大腦中動脈栓塞再灌注后的神經恢復。這表明體內缺血再灌注延遲損傷中程序性壞死是細胞死亡的重要方式，這也為研制開發神經保護藥物以減少細胞壞死提供了新的靶點[6]。雖然神經細胞缺血再灌注損傷后細胞以發生自噬為主，但這可能因為細胞培養皿中缺乏體內缺血再灌注后出現的其他一些影響因素，如TNF-α、FasL等誘導程序性壞死的配基[20]。

上述實驗表明，離體細胞缺血再灌注中細胞死亡的方式主要以自噬為主；而在體環境中細胞因所處環境更復雜，參與細胞死亡的因素更多，可能細胞的壞死以程序性壞死為主。在視網膜缺血模型中，Nec-1預處理組與對照組相比可有效保護視網膜，且在缺血后再給予Nec-1依然有明顯保護作用[21]。神經元缺血模型中，發現聯合應用Nec-1和凋亡抑制藥(HNG，Gly14-humanin)后神經保護效果較好[22]。有關缺血再灌注損傷與程序性壞死的研究仍然較少，且根據不同的器官中細胞發生程序性壞死的組成不同，Nec-1的療效也各有差異[23]，缺血再灌注損傷與程序性壞死的研究還有待進一步深入。

4 結語和展望

程序性壞死是一種新的細胞死亡方式，已有證據表明它在免疫調節、組織損傷和癌癥進展等方面具有重要作用。程序性壞死可被多種刺激誘導，也可被necstatin-1抑制。RIP1和RIP3壞死體是程序性壞死中的重要參與者。目前，程序性壞死的分子機制尚未完全清楚，如FADD在其中的作用并不清晰。程序性壞死的研究必然會為疾病治療發現更多的治療靶點。

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Molecular mechanism of necroptosis and its effect in IR injury

YE Zhou-heng, LIU Wen-wu, SUN Xue-jun*

(Dept. of Diving Medicine, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Necroptosis is a special cell necrosis that is capable of being regulated through particular molecular mechanism. Multiple stimuli could induce necroptosis, complex Ⅰ, complex Ⅱ and RIP1-RIP3 necrosome are critical participants in the necroptosis. Also, necrostatin-1 is a special and potent small-molecular inhibitor of necroptosis. Necroptosis could be an important alternative for cell death in ischemia-reperfusion injury.

necroptosis; receptor interaction protein kinase 1; receptor interaction protein kinase 3

2013-06-13

2013-09-24

*通信作者(correspondingauthor)： sunxjk@hotmail.com

1001-6325(2014)03-0414-04

短篇綜述

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