QuEchERs-GC法測定蜜蜂生物體的氟胺氰菊酯殘留

陳 芳 李 熠 王 勇 曹葳蕤 魏 月 吳黎明

（1中國農業科學院蜜蜂研究所；2農業部蜂產品質量安全風險評估實驗室）

引 言

蜂螨是蜜蜂的天敵，也是蜜蜂最為嚴重的病害。西方蜜蜂幾乎100%感染大蜂螨，且蜂群每年要用藥物防治1～3次，才能保證蜂群正常繁衍。氟胺氰菊酯因其對蜜蜂低毒而對蜂螨的極強殺傷力而被常運用于螨害的防治中[1]。當向蜂巢中噴灑藥物時，由于蜜蜂的衛生行為，大部分的藥物會因蜜蜂吞咽活動進入蜜蜂體內；此外，氟胺氰菊酯具有揮發性，蜜蜂在掛有螨片的蜂箱中活動，其身體表面會沾染藥物。由于蜜蜂的高敏感性和短的生命周期，多數藥物在很短的時間內在蜜蜂體內的殘留都將降至一個很低的水平，但由于氟胺氰菊酯易穩定地積累于巢脾中[2，3]，巢脾（或巢礎）的循環利用使其成為藥物的二次污染源[4]。蜜蜂在蜂箱內可自由活動，氟胺氰菊酯就很可能粘附在蜂足上到處散布，藥物殘留就轉移到了蜂產品中，造成蜂產品的污染[5]，并在蜜蜂體內產生蓄積[6]。由于氟胺氰菊酯具有發育和生殖毒性，其殘留對消費者存在一定的健康風險[7]，歐盟已將其列入了內分泌干擾物名單[8]。因此，本研究擬建立一種快速、簡便、廉價、高效、穩健和安全的（QuEch－ERs）蜜蜂體內氟胺氰菊酯殘留檢測方法。通過測定蜜蜂體內氟胺氰菊酯的殘留來監測蜂產品可能的污染情況。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜－電子捕獲檢測器（美國Agilent公司）；色譜柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm,HP-5或相當者）；天平;均質器;旋轉蒸發儀;氮吹儀;離心機；冷凍研磨儀；冰箱；QuEchERs基質分散固相萃取管。

氟胺氰菊酯標樣（1000 mg/L,1ml;sigma）。正己烷、乙腈均為色譜純（美國 J.T.Baker公司）；實驗用水為去離子水。

1.2 蜜蜂樣品提取

取5只蜜蜂用液氮冷后迅速在冷凍研磨儀中粉碎，將粉碎后的蜜蜂轉移至15 ml QuEchERs基質分散管中，用10 ml乙腈/水（v/v）=5:1分次清洗粉碎池，并且將清洗溶液收集至15 ml分散管中。旋轉振蕩提取30 min，取出離心管在8000 rpm/min轉速下離心5 min，取上清液，上清液氮吹至1 ml，殘渣再用8 ml的乙腈提取一次，5000 rpm/min離心后取上清液至上一次濃縮的小管中，氮吹至干后用2 ml正己烷復溶過濾備用。

1.3 色譜分析

進樣口：260℃ 不分流

檢測器（μECD）：290℃

程序升溫：100℃保留1 min

8℃/min升至230℃，保留5 min

10℃/min升到290℃，保留3.75 min

載氣：高純氮（>99.999%）

流速：1 ml/min

進樣體積：1μl

0.1 mg/L的標樣經氣相色譜分離后色譜圖見圖1。

圖1 氟胺氰菊酯標樣圖

2 結果與討論

2.1 樣品的提取與凈化

蜜蜂樣品是生物樣品，且蜜囊內存有粘稠的蜂蜜樣品，普通的冷凍后機械粉碎效果不佳，因此在液氮迅速冷凍下用冷凍研磨儀進行組織搗碎后再進行目標化合物的提取。為了實現快速、高效、準確的樣品前處理，選擇了商品化的QuEchERs基質分散管，實現提取凈化一體完成。根據藥物及基質的性質，選擇了PSA、GBC和C-18等3種可能適合的填料進行提取凈化，PSA（N-丙基乙二胺）是一種固相吸附劑有比氨基柱更強的離子交換能力。廣泛用于植物農殘分析樣品的處理，去除有機酸、色素和金屬離子；C-18用于吸附樣品中的脂類物質，而GCB（石墨化炭黑）去除色素的效果很好。將這3種填料組合后最終選擇的QuEchERs基質分散管的內容物分別是:①150 mg PSA，45 mg GCB，900 mg無水 MgSO4；②150 mg PSA，150 mg C-18，900 mg無水 MgSO4；③150 mg PSA，900 mg 無水 MgSO4。

實驗結果顯示：①號基質分散固相萃取能夠有效地去除色素及其他基質干擾，提取溶液澄清透明且色譜圖干凈，但目標化合物的回收率略低；②號基質分散固相萃取后的溶液基本無色且透明，且目標化合物出峰時間段沒有基質干擾，回收率也符合農獸藥殘留分析要求；③號基質分散固相萃取液顏色較深，且色譜圖中雜峰較多，凈化不完全，長時間多次進樣可能會造成進樣口、柱子及檢測器的污染。

綜合上述結果，本研究選擇了②號基質固相分析體系。各種填料回收率比較的結果見表1。

表1 3種基質固相分散填料對蜜蜂樣品中氟胺氰菊酯的提取效率比較

2.2 方法的線性、準確性及精密度

為確定標準曲線的線性，以 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L等5個濃度對應的峰面積建立標準曲線，直線回歸的相關系數為0.9964，說明氟胺氰菊酯在102的動態范圍內具有很好的線性，能夠涵蓋日常分析工作中的濃度變化范圍。以空白加標樣品中目標化合物出峰時間左右兩側基線為噪聲，3倍性噪比為檢出限，該方法的檢出限為4.52μg/kg，以10倍性噪比計算定量限，定量線為15.1μg/kg。另外，采用了不同濃度的加標回收來確定方法的準確性，加標濃度為20μg/kg、50μg/kg及100μg/kg，回收率為64.3～107.2%，以同日及隔日加標樣品的相對標準偏差來計算方法的精密度，日內偏差為4.3～8.9%，日間為6.7～11.7%，符合農獸藥分析要求。具體結果見表2。

表2 方法的準確性及精密度

2.3 蜜蜂樣品的測定

運用上述分析方法，我們測定了掛螨片蜂群中蜜蜂體氟胺氰菊酯殘留情況，共采集7個蜂群蜜蜂樣品63個，時間跨度為掛片當天至掛片后65天，施藥濃度為不掛片、半片、1片及2片。結果顯示，未施藥時，所有蜂群的蜜蜂樣品中氟胺氰菊酯殘留基本處于檢出限附近，個別樣品為未檢出；施藥后，在未掛螨片的蜂群中，蜜蜂體內的氟胺氰菊酯殘留水平顯著低于施藥蜂群，但其變化規律與用藥蜂群基本一致，在3～7天達到峰值，之后迅速下降，13天以后緩慢下降，至45天后殘留水平基本在檢出限附近；不同用藥水平對蜜蜂體殘留的影響主要體現在殘留峰值上，最大施藥蜂群的殘留峰值可高達1 mg/kg，在13天后差異不明顯。

圖2 不同用藥水平對蜜蜂體內氟胺氰菊酯殘留的影響

3 結論

用液氮冷凍研磨，QuEchERs固相基質分散提取凈化蜜蜂樣品，是一種快速、高效、準確的樣品前處理方法，PSA和C-18能有效地去除糖類、脂類及少量色素類物質的干擾，達到有效凈化。該方法具有能涵蓋日常測定需求的線性范圍、準確度和精密度。蜜蜂樣品的分析表明，蜜蜂體內的氟胺氰菊酯殘留峰值主要集中在施藥后的3～7天，由于藥物的自然揮發及蜜蜂生命周期短等原因，蜂群中蜜蜂體內的氟胺氰菊酯殘留急劇下降，其殘留水平在檢出限附近。

[1]代平禮，王強，孫繼虎，等.4種農藥對意大利蜜蜂的毒力測定.農藥,2007（08）:546-547.

[2]Tsigouri,A.D.,U.Menkissoglu-Spiroudi,and A.Thrasyvoulou,Study of tau-fluvalinate persistence in honey.Pest Management Science,2001.57（5）:467-471.

[3]Corta,E.Bakkali,A.Barranco,A.et al.,Study of the degradation products of bromopropylate,chlordime form,coumaphos,cymiazole,flumethrin and tau-fluvalinate in aqueous media.Talanta,2000.52（2）:169-180.

[4]Fries,I.,K.Wallner,and P.Rosenkranz,Effects on Varroa jacobsoni from acaricides in beeswax.Journal of Apicultural Research,1998.37（2）:85-90.

[5]Lodesani,M.Costa,C.Serra,G.et al.,Acaricide residues in beeswax after conversion to organic beekeeping methods.Apidologie,2008.39（3）:324-333.

[6]Skerl,M.I.S.,V.Kmecl,and A.Gregorc,Exposure to Pesticides at Sublethal Level and Their Distribution Within a Honey Bee（Apis mellifera）Colony.Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,2010.85（2）:125-128.

[7]Http://pesticideinfo.org/Detail_Chemical.jsp Rec_Id=PC38853

[8]Food and Drug Administration of the United States.Pesticides tolerances.http://www.cfsan.fda.gov