唐山地區福氏志賀菌超廣譜β-內酰胺酶基因型和同源性的分析

高春燕，高慶雙，劉樹平，許林驥，王晶晶，鄭建霞

(唐山市婦幼保健院 檢驗科， 河北 唐山 063000)

研究論文

唐山地區福氏志賀菌超廣譜β-內酰胺酶基因型和同源性的分析

高春燕*，高慶雙，劉樹平，許林驥，王晶晶，鄭建霞

(唐山市婦幼保健院 檢驗科， 河北 唐山 063000)

目的了解唐山地區福氏志賀菌的耐藥特征，明確其所攜帶超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)的基因型和菌株之間的相關性。方法用紙片擴散法作ESBLs確證試驗；對產ESBLs的菌株用微量肉湯稀釋法測定其MICs；用PCR擴增ESBLs基因并測序；通過可變數目串聯重復序列(VNTR)進行同源性分析。結果用紙片擴散法檢出具有ESBLs表型的19菌株，經瓊脂稀釋法檢測，同樣具有ESBLs表型。菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢哌酮、哌拉西林、阿莫西林-克拉維酸和環丙沙星的不敏感率為95%～100%，對其他藥物敏感率均在84%以上。其型別主要為CTX-M-14、CTX-M-3、CTX-M-57和TEM-1。 同源性分析19株福氏志賀菌分為4個克隆系。結論唐山地區兒童福氏志賀菌呈多重耐藥，對第3代頭孢菌素耐藥性有增加趨勢，所攜帶基因型主要為CTX-M-14，首次檢出CTX-M-57基因型。唐山地區存在遺傳緊密相關的福氏志賀菌流行克隆，也存在不相關克隆。

福氏志賀菌；超廣譜β內酰胺酶；基因型；VNTR；同源性

志賀菌屬是導致兒童急性腹瀉的重要原因。抗菌藥物的使用導致了多重耐藥(multi-drug resistance,MDR)的志賀菌屬菌的產生，給臨床治療提出了新的挑戰。由于志賀菌具有多種血清型和亞型，且耐藥性越來越嚴重[1-2]，而產超廣譜β-內酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)是導致志賀菌耐藥的主要原因，近年來，TEM、SHV、CTX-M、TOHO和PER型ESBLs在志賀菌屬菌中均有報道。為探討志賀菌的耐藥機制和流行趨勢，本研究對唐山婦幼保健院分離自兒童腹瀉患者的福氏志賀菌中的ESBLs進行了研究，通過可變數目串聯重復序列(variable number of tandem repeat,VNTR)進行同源性分析，來判斷菌株間是否存在克隆株，以控制爆發流行。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2007年4月至11月唐山婦幼保健院分離的產ESBLs的福氏志賀菌19株。均為急性痢疾患兒的糞便標本(經患兒家屬同意)。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 ESBLs檢測

參照CLSI推薦的紙片確證法檢測菌株是否產ESBLs，如果菌株對頭孢他定(30 μg)或頭孢噻肟(30 μg)的抑菌圈直徑比其加入克拉維酸(10 μg)后的抑菌圈直徑≥5 mm，則認為菌株產ESBLs。對產ESBLs的菌株進一步用微量肉湯稀釋法測定其MICs，菌株對頭孢他定或頭孢噻肟的MICs比其加入克拉維酸后MICs≥8倍，即菌株表達ESBLs。所有結果按CLSI M100-S18(2008)判定。分為敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)。

1.3 PCR擴增ESBLs基因并測序

對于所有經表型檢測產ESBLs的菌株，PCR擴增TEM、TEM、SHV、CTX-M、PER和OXA型酶的基因并測序，引物見表1。

1.4 VNTR分型

對19株產ESBLs的菌株進行VNTR同源性分析，引物序列見表2。

表1 PCR引物及反應條件Table 1 PCR primer and reaction condition

表2 VNTR引物Table 2 VNTR primer

2 結果

2.1 菌株藥敏結果及ESBLs檢測

19株菌均具有ESBLs表型。其藥物敏感性見

表3，菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢哌酮、哌拉西林、阿莫西林-克拉維酸和環丙沙星的不敏感率為95%～100%，對其他藥物敏感率均在84%以上。

2.2 ESBLs基因檢測

19株具有ESBLs表型的福氏志賀菌中有17株表達CTX-M-14，1株表達CTX-M-57，1株表達CTX-M-3。1株blaTEM基因擴增陽性，經測序為TEM-1型廣譜β-內酰胺酶，該菌株同時表達CTX-M-14圖1。其他酶型擴增均為陰性。

表3 19株產ESBLs的福氏志賀菌抗菌藥物敏感性Table 3 Drug susceptibility result of 19 producing ESBLs strains of Shigella flexneri

-.No recommend to fold point in the CLSI.

No2/No.16 CTX-M-1 gene is identified as CTX-M-3,CTX-M-57 after amplification; other CTX-M-9 gene isidefied as CTX-M-14 after ampilification; No.14 gene is identified as CTX-M-14 and TEM

圖119株福氏志賀菌ESBLs基因PCR擴增電泳圖譜
Fig1PCRamplificationelectrophoresispatternofESBLsgenotypesin19Shigellaflexneriisolates

圖2 19株福氏志賀菌VNTR電泳圖譜Fig 2 VNTR amplification electrophoresis pattern of ESBLs genotypes in 19 Shigella flexneri isolates

2.3 VNTR分型分析

19株福氏志賀菌的VNTR指紋圖見圖2。根據片段大小可分為A、B、C及D 4個克隆組，A組1、4、6、11、12和14為同一克隆；B組2、5、7、10和15為同一克隆；C組3、9、13、16和18為同一克隆；D組8、17和19為同一克隆。

3 討論

福氏志賀菌是唐山婦幼保健院分離自兒童腹瀉患者大便標本的主要致病菌，本研究所收集的19株產ESBLs的福氏志賀菌，均以水解頭孢噻肟CTX-M型酶為主，而對頭孢他定非常敏感。中國腸桿菌科菌所產ESBLs以CTX-M型酶為主，其中又以CTX-M-3、CTX-M-9、CTX-M-14為主[7]。已有報道在中國的福氏志賀菌中檢出了CTX-M-14型ESBL，該研究中菌株也對頭孢噻肟耐藥而對頭孢他定敏感，且經結合實驗證明，其耐藥性可經質粒水平傳播[10]。

本研究所收集的19株產ESBLs的菌株，所分離患者均為兒科病房1～8歲患者，分離時間為患者住院后4～13 d，因此菌株所攜帶CTX-M-14型ESBLs很有可能來自其他產CTX-M-14的腸桿菌科菌。近年來不斷在志賀菌中檢出新的基因型，如已檢出 CTX-M-3型[4，11]和CTX-M-55型[12]。本研究中首次在福氏志賀菌中分離出CTX-M-57型，這些酶均屬CTX-M-1組。19株福氏志賀菌的VNTR指紋圖根據片段大小可分為A、B、C及D 4個克隆組，A組1、4、6、11、12和14為同一克隆；B組2、5、7、10和15為同一克隆；C組3、9、13、16和18為同一克隆；D組8、17和19為同一克隆，說明菌株存在一定的親緣性，存在遺傳緊密相關的福氏志賀菌流行克隆，也存在不相關克隆。防控不當及易引起小范圍暴發流行。

ESBLs的出現，給志賀菌感染的治療和防控帶來了壓力，應加強其耐藥性監測，以指導臨床醫生規范使用抗生素。通過對菌株同源性的檢測，對預防和控制菌痢的流行具有十分重要的意義。

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下肢潰瘍新療法：皮膚噴霧

據英國《BBC新聞》(BBC NEWS)(2012-08-03)報道，科學家表示，已研發出革新的“皮膚噴霧”來治療下肢靜脈潰瘍。這種常見疾病病癥包括在腳踝、下肢有淺層開放性頑固傷口。

科學家使用皮膚細胞噴霧治療美國和加拿大228名患者，發現細胞噴霧能大幅改善并加速傷口愈合，是其中有助止血的蛋白質混合物所制。

德州生技制藥公司Healthpoint Biotherapeutics研究員史雷德(Herbert Slade)說：“這項治療試驗，有大幅改善下肢潰瘍恢復時間與整體恢復情形的潛力，患者不需接受植皮手術。”患者傷口同時需以正規治療的加壓繃帶包扎。

研究發表于《柳葉刀》(The Lancet)醫學期刊。據研究報道，英國患有下肢靜脈潰瘍的人口比例約1/500，但80歲以上人群就飆升至1/50。

下肢靜脈潰瘍好發于年長或肥胖等無法適度移動的人群以及靜脈曲張患者，主因是腿部持續處于高壓，導致靜脈擴張、皮膚受損。

標準治療包括加壓繃帶固定、控制感染以及敷料，但并非所有傷口都能治愈。醫生有時也會為患者植皮，但會導致取下皮膚處又形成新傷口。

澳洲果蝠為破解致命病毒提供希望

據英國《BBC新聞》(BBC NEWS)(2012-08-03)報道，澳洲果蝠體內已發現一種病毒，基因非常接近立百病毒(Nipah)與亨德拉病毒(Hendra)。研究人員希望，通過DNA分析有助于找出這兩種致命病毒的治療方法。

人類感染立百病毒的死亡率為40%～75%，亨德拉病毒一般是馬受到感染，人類感染的死亡率則是50%以上。

這個新發現的Cedar病毒有90%基因與亨德拉病毒及立百病毒相同，但當研究人員將Cedar病毒注射至老鼠、天竺鼠以及雪貂身上時，未產生任何疾病。

研究主筆、澳洲聯邦科學與工業研究組織澳洲動物衛生實驗室(CSIRO’s Australian Animal Health Laboratory)的克雷馬利(Gary Crameri)說，研究人員正在比較這3種病毒的DNA，以期找出造成立百病毒與亨德拉病毒致命的基因，進而找出治療方法。

亨德拉病毒造成的馬匹死亡率高達75%，盡管傳染人體的情形罕見，不過在澳洲1994年以來記錄有案的7起人體病例中，就有4人死亡。

研究刊登在《公共科學圖書館病原體》(PloS Pathogens)期刊上。

Extended-spectrum β-lactamases genotypes and homologous analysis ofShigellaflexneriisolates in Tangshan

GAO Chun-yan*, GAO Qing-shuang, LIU Shu-ping, XU Lin-ji, WANG Jing-jing, ZHENG Jian-xia

(Dept. of Clinical Laboratory,Tangshan Municipal Maternal and Child Care Hospital, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo analyze the resistant spectrum and the extended-spectrum β-lactamase genotypes of clinical isolates and homologous analysis ofShigellaflexneriin Tangshan.MethodsSensitivity testing was perfomed by K-B disk diffusion method ESBLs confirmation experiment. The MICs against ESBLs-producting were determined by trace broth dilution method.PCR method was employed to detect the genotypes of ESBLs producing strains. The PCR products were analyzed by DNA sequencing. Through the variable number tandem repeats (VNTR) homology analysis.ResultsESBLs were idenitified in 44.2%(19/43) ofShigellaflexneriisolates. So did MICs. 95～100% of these isolates were susceptible to ceftriaxone, cefotaxime, cefoperazone, piperacillin, amoxicillin-clavulanate.More than 84% these isolates were susceptible to other antibiotics. The genotypes of these stains included CTX-M-14, CTX-M-3、CTX-M-57 and TEM-1. Homology analysis 19 strains of shigella’s blessing is divided into four clones.ConclusionsShigellaflexneriisolates in Tangshan were multi-drug resistant with it is increased resistance to third generation cephalosporin. The main genotypes of ESBLs wasCTX-M-14. The first detectedCTX-M-57 genotype.Both genetic-related clones and non-related clones ofShigellaflexneriin Tangshan.

Shigellaflexneri； extended-spectrum β-lactamase；genotype；VNTR；homology

2013-06-25

2013-10-09

2012年河北省第十七批科學技術研究與發展計劃項目(12277715)

*通信作者(correspondingauthor)： gcy3726694@aliyun.com

1001-6325(2014)02-0196-05

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