腦損傷和補骨脂二氫黃酮對大鼠脛骨骨折愈合過程中5-HT、VEGF的影響*

季衛鋒 傅永波 陸吳超

（1.浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江 杭州 310006；2.浙江省諸暨市中醫醫院，浙江 諸暨 311800；3.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

多年來人們在臨床實踐中觀察到骨折合并腦外傷患者骨痂過度生長，甚至在肌肉中出現異位骨化，比單純骨折患者愈合速度明顯加快。自Roberts［1］于1968年首次報告腦外傷后出現異位骨化，國內外許多學者對骨折合并腦外傷的骨折愈合和異位骨化進行了研究。 Bose M［2］等研究發現合并腦外傷的大鼠股骨干骨折愈合時間明顯短于單純股骨干骨折組。Zwerina J［3］等發現骨折伴腦外傷者骨折愈合過程中出現大量骨痂，骨折愈合加快。中醫古籍《本草經疏》有記載“補骨脂，能暖水臟，陰中生陽，壯火益士之要藥也”，補骨脂具有補腎壯陽、固精縮尿的功效。近年來國內外對補骨脂提取物的研究也很多，宋芹［4］等研究表明補骨脂提取物具有明顯的抗骨質疏松作用。楊榮平［5］等研究表明補骨脂乙酸乙酯提取物和乙醇提取物均可促進成骨細胞分化、增殖。Wong RW［6］等研究發現補骨脂提取物口服能增加骨密度和骨的組織形態學改變。

臨床上補骨脂對于治療骨折、股骨頭壞死及骨質疏松有良好的療效，而骨折合并腦外傷的患者又有明顯加快骨折愈合的作用。國內外雖然關于研究骨折愈合的文章很多，但是對于腦外傷及中藥單體如何促進骨折愈合的機理尚不十分明確。本實驗通過對大鼠脛骨骨折愈合的研究，比較腦外傷及補骨脂二氫黃酮對骨折愈合過程中5-羥色胺（5-HT）、血管內皮生長因子（VEGF）含量的大小，闡明腦外傷及中藥促進骨折愈合機理的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠42只，6～8周齡，體質量（200±20）g，雄性。浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。將大鼠飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心無特定病原體動物（SPF）級環境下，室內定期進行紫外線照射殺菌，籠具、墊料、飲水、飼料等均嚴格消毒。

1.2 試藥與儀器 10%濃度的水合氯醛，聚維酮碘消毒液，無水酒精，青霉素，生理鹽水，VEGF、5-HT ELISA試劑盒各1個，補骨脂二氫黃酮（粉劑，購自上海恒遠生物科技有限公司，實驗前保存于-15℃的冰箱內）。高壓蒸汽滅菌鍋、自動平衡離心機LDZ5-2、電動鉆孔器、電熱恒溫水浴器DK-S24型、超低溫冰箱、電子天平、熱風循環烘箱、洗板機、酶標儀、隔水式恒溫培養箱、微量高速離心機；手術剪、止血鉗鑷、眼科剪鑷、注射器、燒杯、量筒、試管、離心管、濾膜、25 cm長空心導管、20 g砝碼、直徑5 mm磁性墊片、eppendorf管、手術縫針、外科縫線等。

1.3 分組與給藥 選擇清潔成年雄性SD大鼠42只，6～8 周齡，體質量（200±20）g。將其隨機分為 7 組：正常對照組6只，腦損傷組6只，骨折組6只，腦損傷+骨折組6只、補骨脂二氫黃酮+骨折組按補骨脂二氫黃酮給藥的劑量分大劑量組、中劑量組、小劑量組各6只。各組大鼠分籠飼養，每籠3只。

1.4 模型制備 （1）中度腦損傷模型制備：術前所有大鼠禁食1d，稱體質量，10%水合氯醛腹腔麻醉（3mL/kg）后，消毒，鋪單，自大鼠頭頂正中縱行切一長1.5 cm切口，向兩側分離皮膚，切開骨膜，露出右側顱頂骨約0.8 cm。以中線旁2 mm，前囟后1.5 mm處為中心鉆孔，開直徑約5 mm骨窗，將20 g砝碼于30 cm高處通過導管墜落，撞擊置于硬膜上的墊片致中度腦損傷。止血，聚維酮碘浸泡，縫合頭皮，術畢。術后給予青霉素注射液肌肉注射，用生理鹽水配制成80000 U/mL），每只大鼠40000 U，連續3 d。（2）脛骨骨折模型制備：將大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉（3 mL/kg）后，沿脛骨前外側鈍性分離進入到達脛骨干，在脛骨結節下1 cm處用擺鋸鋸斷脛骨成橫形骨折，以直徑1 mm克氏針作逆行髓內固定，經查骨折固定牢固后，生理鹽水沖洗，關閉傷口，聚維酮碘消毒。術后給予青霉素肌肉注射，用生理鹽水配制成80000 U/mL，每只大鼠予40000 U，連續3 d。（3）腦損傷組+脛骨骨折組造模：同上兩組組合。補骨脂二氫黃酮+骨折組造模：同前脛骨骨折模型；高劑量組：以大鼠每100 g體質量腹腔注射，1.5 mg補骨脂二氫黃酮，每周2次；中劑量組：以大鼠每100 g體質量腹腔注射，0.5 mg，每周2次；低劑量組：以大鼠每100 g體質量腹腔注射，0.1 mg，每周2次。正常對照組不作任何處理。

1.5 標本采集與檢測 正常對照組于實驗開始后第3日，其他6組均于術后3 d，1周，2周，3周，4周，5周取血。實驗采用眼眶取血方法，每次每只大鼠取血約2 mL，將抽取的血液注入消毒過的eppendorf管中，放入裝有冰袋的泡沫盒中冷藏。全部取完后，將血液于低溫條件 （4℃）的冰箱中放置4 h后，3000 r/min離心10min后取上清液，再將上清液過濾除菌后分裝凍存（2 mL/支、-80℃）。 大鼠血清中 VEGF、5-HT 的含量采用ELISA測定法。（1）標準品的稀釋：將標準液按照等體積稀釋5倍后，取液備用。（2）加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。（3）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。（4）配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。（5）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。（6）加酶：每孔加入酶標試劑 50 μL，空白孔除外。（7）溫育：操作同 3。（8）洗滌：操作同 5。（9）顯色：每孔先加入顯色劑 A 50 μL，再加入顯色劑 B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。（10）終止：每孔加終止液50 μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。（11）測定：以空白空調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15min以內進行。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠死亡情況 在實驗造模過程中，正常對照組有1只大鼠在麻醉時死亡，腦損傷組和腦損傷+骨折組在實驗過程中各死亡1只，補骨脂二氫黃酮大劑量組死亡1只，總的實驗大鼠樣本為38只。

2.2 取血離心后各組血清5-HT水平比較 見表1。腦損傷組、骨折+腦損傷組在1周時5-HT水平達最低，1周后濃度呈緩慢上升趨勢，4周后逐漸平穩；而骨折+補骨脂二氫黃酮3個劑量組5-HT水平在5周內只有輕微波動，與骨折組在第3日、在1周、2周差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 取血離心后各組血清5-HT水平比較（ng/L，）

與正常對照組同時期比較，*P＜0.05；與骨折組同時期比較比較，△P＜0.05；與腦損傷組同時期比較，▲P＜0.05。下同。

2.3 各組血清VEGF水平比較 見表2。可以看出各實驗組濃度較正常對照組高，骨折+腦損傷組水平高于單純骨折組和單純腦損傷組，3周后呈下降趨勢；骨折+補骨脂二氫黃酮3個劑量組在1周后，VEGF水平與補骨脂二氫黃酮劑量成正比，5周后均趨向相同水平。

3 討 論

骨折愈合是一個復雜有序且漫長的過程，該過程中有眾多因子參與調控，受多種因素影響。在臨床實踐中骨折合并腦外傷的患者骨痂過度生長，甚至在肌肉中出現異位骨化，骨折愈合明顯加快。早在1987年Perkins［7］發現合并腦外傷骨折患者骨折處骨痂顯著增加，并且愈合時間平均縮短了 4周。Spencer［8］通過研究也得出了相似的結論，并通過對骨痂組織學分析顯示骨痂的特征。VEGF是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可在體內誘導血管新生，在骨折愈合過程中起著重要作用［9］。5-HT是一種吲哚衍生物，廣泛存在于哺乳動物組織中的一種抑制性神經遞質。嚴穎彬［10］發現外周合成的5-HT可充當激素抑制骨形成，抑制外周5-HT的合成可能成為一種通過增強骨的合成代謝治療骨質疏松的新型方法。

表2 各組血清VEGF水平比較（pg/L，）

表2 各組血清VEGF水平比較（pg/L，）

傳統骨折愈合過程分為4期，即血腫形成期，纖維骨痂形成期，骨性骨痂形成期和骨痂改造重塑期。在愈合過程中任何一個環節受到不良影響均會導致骨折延遲愈合或骨折不愈合。隨著現代分子生物學的發展，在骨折愈合過程中，近年來通過研究發現了越來越多起重要作用的骨折生長因子，如血管內皮生長因子，5-羥色胺等，中醫藥對骨折愈合的影響也正逐步走向細胞分子水平，尤其是中藥無論是單味藥還是復方對骨折生長因子的影響逐步受到重視。

本實驗通過對大鼠脛骨骨折愈合的實驗研究，比較腦外傷及補骨脂二氫黃酮對骨折愈合中5-HT、VEGF因子含量的大小，發現單純骨折組大鼠血清中VEGF含量在手術后3 d較少，2周出現峰值，隨后呈下降趨勢，這與武永剛［11］等研究結果相符。他們認為骨折后早期（5～7 d）骨折局部由于出血、組織細胞壞死、炎性細胞反應引起了血流中斷、此時VEGF表達量較弱。隨著骨折修復，肉芽組織增長加快使得血供相對較少，大約在骨折后2周VEGF mRNA表達量達最高，而在骨折修復后期表達呈下滑趨勢。腦損傷組和骨折+腦損傷組的大鼠血清中VEGF含量同樣在2周時達到峰值，但明顯高于單純骨折組，2周后也呈下降趨勢。沈峰等［12］通過實驗發現腦外傷合并骨折患者愈合過程中VEGF在血清含量和骨折局部位點表達高于單純骨折者，他們認為腦外傷后繼發性病理損害引起的腦組織缺血缺氧，誘導腦挫傷灶周圍腦組織VEGF基因表達增高，血液、腦脊液中VEGF濃度升高，通過腦外傷后破壞的血-腦脊液屏障進入血液，使外周血中VEGF含量增高。骨折+補骨脂二氫黃酮3個劑量組進行兩兩比較差異有統計學意義。中、大劑量組在2周后血清VEGF含量高于小劑量組，略呈下降趨勢，3周后血清含量高于其他各組。臨床應用［13］及現代藥理研究結果都表明補骨脂有強筋骨，防治骨質疏松的作用，補骨脂提取物能促進骨再生和重建。體外實驗發現［14］，100 μmol/mL的補骨脂異黃酮和10 μmol/mL的補骨脂二氫黃酮就可以促進成骨細胞的增殖，抑制骨的吸收。從實驗數據看出，補骨脂二氫黃酮進入血液后，很可能刺激誘導外周VEGF基因表達，使外周血液中VEGF濃度維持在較高水平，直接促進骨折愈合。

實驗中還發現，腦損傷組及骨折+腦損傷組血清中5-HT水平在1周時達最高，1周后呈下降趨勢；其余各組均是緩慢下降趨勢。彭瑞云等［15］發現5-羥色胺參與大鼠腦組織損傷的病理過程，5-羥色胺在傷后1 d后表達增強，3 d達高峰，7 d后開始減少，而于14 d后逐漸恢復至正常水平。另外，Tsuiki等［16］用放射自顯影技術，在大鼠腦皮質冷凍損傷模型中也發現，腦損傷后3 d，傷側中縫背核、大部分皮質區和背側海馬5-HT合成率顯著升高，同時伴隨血腦屏障通透性增高。目前5-HT對于骨的調節作用尚處于試驗階段，初步認為當由周圍產生時，5-HT作為激素能抑制骨的形成，相反在腦里產生時，血清素作為神經遞質在骨量增長方面可以通過增加骨形成和限制骨吸收而發揮著一個積極效應。但在腦外傷合并骨折過程中5-HT的合成、釋放、再吸收以及細胞外的功能依然未知。通過本實驗，筆者猜測腦損傷早期5-HT神經遞質合成增加并大量釋放入腦微血管，促進骨折愈合，中后期5-HT通過血腦屏障進入外周血管，使中樞5-HT水平下降，骨折愈合速率減慢。骨折+補骨脂二氫黃酮3個劑量組與骨折組在第3日、在1周、2周差異無統計學意義，初步推斷補骨脂二氫黃酮在促進骨折愈合過程中對5-HT水平改變無明顯影響。

［1］P.H.Roberts，Oswestry.Heteroyopicossification complicating paralysis of intranial origin［J］.Bone and Joint Surgery，1968，50（1）：70-77.

［2］Boes M，Kain M，Kakar S，et al.Osteogenic effects of trauma tic brain injury on experim ental fracture-healing［J］.J Bone Joint Surg Am，2006，88（4）：738-743.

［3］Zwerina J，Redlich K，Polzer K，et al.TNF-induced structural joint damage is mediated by IL-1［J］.Proc Natl A cadsci USA，2007，104（28）：11742-11747.

［4］宋芹，顏軍，郭曉強.補骨脂提取物與羅非魚魚鱗膠原蛋白多肽抗骨質疏松的實驗研究［J］.中藥藥理與臨床，2010，26（6）：59-61.

［5］楊榮平，壽清耀.補骨脂提取物對體外培養新生大鼠顱骨成骨細胞的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18（1）：32-34.

［6］Wong RW，Rabie AB.Systemic effect of fructus psoraleae extract on bone in mice［J］.Phytother Res，2012，24（10）：1578-1580.

［7］Perkins R，Skirving A.Callus formation and the rate of healing of femoral facture in patients with head injuies［J］.Bone Joint Surg（Br），1987，69（4）：521.

［8］Spencer RF.The effect of head in injure on fracture healing［J］.Bone Joint Surg（Br），1987，69（4）：525.

［9］陳雯輝，王大業，麻松，等.腦外傷后血小板衍生因子及血管內皮生長因子對骨折愈合影響的實驗研究［J］.首都醫科大學學報，2007，29（6）：745-752.

［10］嚴穎彬，梁素霞.5-羥色胺在骨生物學的研究進展［J］.中國骨質疏松雜志，2011，17（7）：635-639.

［11］武永剛，陳君長，王坤正.血管內皮生長因子在骨折愈合中的表達［J］.西安醫科大學學報，2001，22（1）：51-53.

［12］沈峰，攀海濤，麻松，等.腦外傷合并骨折患者骨折愈合過程中血管內皮生長因子在血清和骨痂中的表達［J］.首都醫科大學學報，2011，32（5）：681-683.

［13］王全權，陳海林，宗芳，等.補骨脂復方制劑干預絕經后骨質疏松癥的作用［J］.中國臨床康復，2006，35（10）：145-148.

［14］Wang D，Li F，Jiang Z.Osteoblastic proliferation stimulating activity of Psoralea corylifolia extracts and two of its flavonoids［J］.Planta Med，2001，67（8）：748-749.

［15］彭瑞云，高亞兵，肖興義，等.5-羥色胺在大鼠實驗性腦震蕩腦組織中的表達［J］.中華神經外科疾病研究雜志，2002，1（4）：356-358.

［16］Tsuiki K，Takada A，Nagahiro S，et al.Synthesis of seroton in intraumatizedratbrain［J］.JNeurochem，1995，64：1319-1325.